叶绿素仪在河南平原烟区烤烟上的应用

王典　吴照辉　郭芳阳

摘要：为了研究SPAD-502叶绿素仪在河南平原烟区烤烟叶片上的应用方法，选取河南许昌烟区主栽品种中烟100和豫烟系列新品种豫烟9号作为试验材料进行研究。结果显示，在一天中随着光照度的变化，两个烤烟品种叶片的SPAD值也有相应的变化。综合考虑测量的稳定性和可操作性等因素，上午8：00-10：00是测定的最佳时间段。用酒精棉擦拭测点和SPAD仪测试窗口，发现清洁后测得的结果有显著变化。分别在团棵期、旺长期和成熟期等烟叶生长发育期内对两个烤烟品种不同叶位的SPAD值进行分析发现，顶部完全展开叶的第3片叶测定结果相较于其他叶位变异系数较低，测定结果稳定；将顶3叶叶面分为10个测定位点进行分析发现，主脉中部左右两侧位点均值的变异系数和代表系数都较低，结果的稳定性和代表性为最优。

关键词：SPAD叶绿素仪；烤烟；河南平原烟区

中图分类号：S572；Q945.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）03-0051-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.013

Abstract： In order to study the method of SPAD-502 chlorophyll meter application in flue-cured tobacco of Henan plain tobacco region，the field experiment was conducted and choose two varieties Zhongyan 100 and Yuyan No.9 as materials. Results showed that，the leaf SPAD value of two varieties has certain change with the change of light intensity in one day. To comprehensively consider the factors such as stability and maneuverability of measurement，8：00 AM to 10：00 AM is the best determination period. After alcohol-tempon to clean site and test window，the measured results had significant changes compared with before. The leaf SPAD value of two varieties in different sites such as resettling period， vigorous growing period and mature period were analyzed，and it was found that，compared with the other leaves，the determination results variation coefficient of the top fully expanded third leaf was low，so the determination results had better stability；Dividing the top of the third leaf into 10 loci and it was found that the variation coefficient and representation coefficient of mean value of the main central vein left and right sides were low，so the results of the stability and the representative were the best.

Key words： SPAD chlorophyll meter； flue-cured tobacco； Henan plain tobacco region

植物全氮可以很好地反映植物的氮營养状况，并且与作物产量也有较好的相关性[1]，因此植物全氮是一个很好的诊断指标。在烤烟整个生育期内，烟株生长和生理代谢都对氮素十分敏感[2]。然而在中国烤烟生产中存在着过量或过迟施氮的问题，这不仅增加生产成本、降低烟叶产质量，还因为肥料利用率较低引起环境污染[3]。河南作为浓香型烟叶最重要的产区，近年来备受品种的困扰，而外引品种并不能充分彰显本地区的生态优势，本地选育品种具有抗病性强、农田长势良好和浓香型质量风格突出的特点，但耐肥性差、适宜的氮水平范围狭窄，生产中往往由于施肥的问题不能充分彰显品种特性。

传统上多凭借土壤肥力、前茬和烟株的外在特征来调控烟株的营养和判断烟株氮素的丰缺，但往往不够精准或调控出现偏差，而利用测定烟株全氮的方法不仅破坏植株，同时化验周期长、操作麻烦，难以实现作物生长期间的实时监测。因此，实时快速地监测田间烟株的氮素营养状况，进而指导田间烤烟施肥，对于提高氮肥利用效率和烟叶的产量与质量意义重大。氮素是叶绿素的主要组成物质[4]，利用叶绿素仪获得的植株叶片SPAD值（叶绿素的相对含量）与植株氮营养状况具有良好的相关性[5]，并且在检测植株叶片时有快速、简便、无损的特点，便于人们及时采取营养干预和农艺措施来调整作物的生长发育，因此受到广大植物营养学家的青睐，被广泛应用在水稻、小麦、棉花、油菜等大农作物上。陈晓群等[6]利用SPAD值提出了基于水稻不同生育期叶绿素诊断值的氮肥推荐施用量。胡昊等[7]研究发现SPAD值可以进行叶绿素的诊断，并且通过SPAD值可以对冬小麦进行估产。关于烤烟方面的研究也有一些报道，王维等[3]研究发现利用叶绿素仪进行实时氮肥管理，获得了较高的烟叶产质量，烟叶的化学成分更加协调。贺广生等[8]研究发现烤烟K326品种在氮肥实时管理模式下的SPAD阈值40.5～43.0内（氮肥用量为75～110 kg/hm2）能获得较高的烟叶产量、产值和氮肥利用率。

然而，叶绿素在植物叶片中的分布会因物种、测定时期、测定位置的不同而不同，因此SPAD仪测出的结果也不尽相同。柯娴氡等[9]利用SPAD-502叶绿素仪对中国南方4种木本植物叶绿素相对含量进行测定发现，不同物种、不同叶龄、同一叶片不同部位、主脉左右两侧等因素都会对测定结果产生影响。陈琴等[4]测定5种牧草叶片上不同部位的SPAD值得出同一叶片上叶尖部>叶中部>叶基部的特点，叶中部的值稳定且更接近平均值，是最佳测定部位。烟草叶片在成熟期叶长能达到60～72 cm，叶宽30～40 cm，叶片数达到18～23片。烟草叶片宽大及叶片数多的特点，导致叶绿素含量分布有差异，选择哪片叶、同一叶片的测定部位以及测定时间等都需要进行综合考量，才能确定最能代表该烟叶的叶绿素相对含量的部位，目前关于SPAD叶绿素仪在河南平原烟区烟叶上的使用方法还没有系统研究，针对河南平原烟区主栽品种的研究更少。为此，试验选择河南主栽品种为研究材料，利用SPAD-502叶绿素仪测定两个品种在一天中不同时间点、不同生育时期不同叶位、是否用酒精清洗叶片和测试窗口等的SPAD值，确定两个品种适宜的SPAD值测定位置，以期建立SPAD-502叶绿素仪在河南平原烟区的应用方法体系，为评价河南平原烟区烤烟烟叶的生长性能和营养状况提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验在河南省农业科学院烟草研究所实验地进行，供试土壤为潮褐土。供试品种是河南省主栽品种中烟100和河南省推广应用的豫烟系列新品种豫烟9号。试验肥料用量为两个品种的习惯施肥水平：中烟100的氮肥用量为施纯氮67.5 kg/hm2，豫烟9号的氮肥用量为施纯氮45 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，试验所用肥料为硝酸磷铵、过磷酸钙、硫酸钾。试验小区长23 m，宽1.2 m，每个处理4行，每个处理面积110.4 m2。

1.2 测定项目和方法

1）测定时间。在烟叶旺长期的某一晴朗天气（此阶段是烟叶生长发育最快时期，烟叶的光合作用最强），每个品种选择长势一致的烟株5株，固定某一叶位（顶3叶），从6：00到19：00，每隔1 h测定两个品种叶片的SPAD值，并绘制成曲线；同时用照度仪测定一天中不同时段的光强并绘制成曲线。

2）叶位和位点的选择。分别在烟叶生长的团棵期、旺长期和成熟期，每个品种选择长势一致的烟株5株，用SPAD-502叶绿素仪测定每株顶部3片叶片的中部，每片叶测定4次，取其平均值作为该叶片的SPAD值。分别在烟叶生长团棵期、旺长期和成熟期选择长势一致的烟株5株，将顶部第3片叶片沿烟叶边缘（SPAD-502叶绿素仪测试窗口能测到的最深位置）分成A、B、C、D、E、F、G、H、J、K等10个测量点（图1），测定各个位点的SPAD值，每个位点测定4次，取平均值作为此位点的SPAD值。由于叶脉对SPAD-502叶绿素仪的读数有影响，因此，测量时应避开叶脉集中的部位，以减小测量误差。

3）参数计算。烤烟叶片相对较大，同一叶片不同位置的SPAD值不同，鱼欢等[10]认为要通过综合叶片SPAD值的代表系数和变异系数来确定能代表叶片叶绿素水平的SPAD值。代表系数由所测位点的SPAD值与整个叶片各位点平均值差值的绝对值表示，代表系数越小表示所测SPAD值越能代表该叶片的真实值；变异系数则是由各位点所测SPAD值的标准差与该位点的平均值的比值表示，变异系数越小，说明该位点的SPAD值越稳定。

计算方法：代表系数=│测定位点SPAD值-平均值│，变异系数=测定位点SPAD值的标准差/平均值。

1.3 数据处理

应用Excel 2010进行数据汇总及初步处理，采用Origin 9.0绘制图表，采用SPSS 20.0统计软件进行5%水平的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 測定时间对烟叶SPAD值的影响

从图2a可得，一天中从6：00到19：00的光强呈抛物线变化趋势，即先升高后降低，中午从11：00开始光强急剧加强，12：00-13：00光强最强，14：00后光强逐渐下降，但仍处于较强的光照。在8：00-10：00、12：00-14：00两个阶段，两个品种烟叶的SPAD值处于较稳定阶段（图2b），其他时段SPAD值的波动较大，这两个阶段是利用SPAD仪进行测定的最佳时段。综合考虑，12：00-14：00是一天中光强最强的时间，此时田间温度最高，不宜于进行大田测定，而8：00-10：00光强较弱，温度相对较低，SPAD测定值较稳定，是大田测定SPAD值的理想时间。

2.2 叶位的选择对烟叶SPAD值的影响

从表1可知，团棵期，两个品种顶部3片叶的SPAD值没有显著变化，中烟100顶1叶和顶3叶的变异系数较低，豫烟9号顶部3片叶中变异系数较低的是顶3叶；旺长期，两个品种顶部3片叶子的SPAD值从上到下依次升高，中烟100顶2叶和顶3叶的变异系数较低，而豫烟9号顶部3片叶子中变异系数最低的是顶3叶，为0.02；而在成熟期，中烟100顶部3片叶的SPAD值没有显著变化，其中顶3叶的变异系数最低，豫烟9号顶部3片叶的SPAD值依次呈现不显著的降低趋势，而顶1叶和顶3叶的SPAD值相对较低。综合不同时期的比较结果，顶部完全展开叶的第3片叶是测定SPAD值的最佳叶位。

2.3 位点的选择对烟叶SPAD值的影响

烤烟叶片上10个测量位点的划分见图1。由表2可知，团棵期，中烟100顶3叶SPAD值代表系数较小的位点在（C+H）/2、（B+G）/2，即叶片中部和中部靠基部的位置；旺长期，中烟100顶3叶各个位点中SPAD值代表系数较低的位点为（B+G）/2、（C+H）/2、（D+J）/2，即叶片的中部位置；烟株进入成熟期后，顶3叶上代表系数较低的位点为B、C、J、K。从这3个时期可知，叶中部的SPAD值代表系数较低，与整个叶片的平均值最接近，最能代表叶片的SPAD值。3个时期顶3叶各位点的SPAD值没有显著变化，但这3个时期中（C+H）/2位点的SPAD值变异系数均为最小值，说明这个位点测定的SPAD值最稳定。综上，中烟100在团棵期、旺长期和成熟期均表现在叶片中部测定的SPAD值代表系数最低，数值相对稳定，因此测定中烟100的叶片SPAD值的最适位置是顶3叶中部叶脉两侧的均值。

由表3可知，豫烟9号在团棵期阶段顶3叶各位点SPAD值的代表系数较低的位点有C、H、（B+G）/2、（C+H）/2，且代表系数较高的位点有E和K，说明靠近叶尖部的SPAD代表系数较大不适宜作为测定位点；旺长期时，10个基本位点中C、D、K代表系数较低，均值点中（C+H）/2、（E+K）/2代表系数较低；烟株进入成熟期后，代表系数较低的位点有J、（B+G）/2、（C+H）/2、（D+J）/2，基本都在叶片中部位置。综上可知，3个时期中，豫烟9号顶3叶中部叶脉两侧均值（C+H）/2的代表系数最小，是最适合的测定部位。在团棵期和旺长期，顶3叶各位点的SPAD值没有显著区别，进入成熟期，由于叶片成熟落黄，叶尖部的SPAD值明显低于其他部位。并且，这3个时期中（C+H）/2位点的变异系数均相对较小，说明这个位点获得的SPAD值较稳定。综上所述，豫烟9号在各个时期最能代表烟株叶片SPAD值的位点为顶3叶中部叶脉两侧的均值。

因此，最佳测定部位是叶片中部两侧。顶3叶中部叶脉两侧SPAD值的均值最能代表烟株叶片的SPAD值。

2.4 酒精处理叶片对SPAD值的影响

中烟100移栽后25 d（图3a），经过酒精擦拭后，叶片的SPAD值与未处理相比变化趋势一致，方差分析结果表明，经过酒精擦拭的叶片SPAD值呈现显著降低；移栽后70 d（图3b），经过酒精处理后同样出现了显著降低，但酒精擦拭前后的变化值小于移栽后25 d。同样的，酒精擦拭对豫烟9号叶片的SPAD值有显著影响（图3c、3d）。因此，在测定烟叶叶片SPAD值时，需要用酒精棉对测点和测试窗口进行擦拭，然后再进行测定。

3 小结与讨论

3.1 测量点和时间的选择

试验结果表明，中烟100和豫烟9号各个生育期用SPAD叶绿素仪诊断氮素营养时，时间上选择一天中的8：00-10：00，选择顶部完全展开叶的第3片叶子，主脉中部两侧每个位点测定4次，取其平均值作为该叶片的SPAD值。测定时要用酒精棉将测定位点和测试窗口擦拭干净。

SPAD仪主要用于营养快速诊断、叶绿素含量预测、氮素含量监测等方面，研究手段多样，研究结果也不尽相同。李鹏程等[11]发现棉花早熟品种主茎叶全生育期SPAD值呈现倒1叶<倒2叶<倒3叶<倒4叶的规律，而中熟品种在盛铃期以前主茎4片叶SPAD值也呈现和早熟品种相同的规律，但盛铃期以后SPAD值叶序变化不规则。有研究认为水稻叶片上距离叶基部1/2处的SPAD值稳定，是合适的测定位点[12]；但也有研究认为最佳的测定位点为距离叶基部2/3处[13]。在棉花上，有的选择功能叶的底部、中部、基部，也有的在功能叶上均匀地测定5个点，求得平均值代表这个叶片的SPAD值水平[14]。徐照丽等[15]在云南省的田间试验得出叶绿素仪在烤烟上的最佳测量部位为叶片基部；而李佛琳等[16]分析了烟株叶位和叶片部位的叶绿素计值发现叶绿素计测定烟叶时叶片各个部位均可选择，但从稳定性和可操作性考虑，烤烟最佳测定部位为完全展开叶的中部。王维等[3]的研究结果表明，顶3叶的叶中位置SPAD值与叶片叶绿素含量、总氮含量的相关性最好，且变异系数小，是较为理想的指示叶或参照叶。本研究参考鱼欢等[10]对胡椒叶片SPAD值的研究，烟叶SPAD值的测量部位需要考虑叶片SPAD值代表性和稳定性，由于烟叶叶片的特殊性，还需要考虑叶位和位点的选择。中烟100在团棵期、旺长期和成熟期3个时期顶部第3片叶的变异系数较低，说明测得的SPAD值最稳定，因此中烟100测定SPAD值的最佳叶位应选择顶部第3片叶。豫烟9号得出同样的结果。综上，中烟100和豫烟9号测定SPAD值在叶位上应选择顶部第3片叶。叶位选择上，由于烟叶面积大，不同部位植物叶肉组织成熟程度不同植物光生态情况不同[4]，所测SPAD值结果不同，因此将烟叶叶片按照主脉对称沿叶边缘（SPAD-502仪测试窗口能测到的最深位置）分为10个测量点，结果显示，中烟100和豫烟9号在团棵期、旺长期和成熟期顶3叶SPAD值代表系数较小的位点均在叶片中部位置，说明叶片中部所测的SPAD值与平均值最接近，此位置最具有代表性。变异系数代表所测位点SPAD值的稳定性，比较各个位点的变异系数发现，两个品种在各生长时期的变异系数相对其他位点都较低，综合考虑各位置读数的稳定性及其代表性，叶片中部的SPAD值与整个叶片各位置SPAD值的平均水平最接近，最能代表该叶的平均水平。因此综合各位点测定结果的稳定性和代表性发现，烟叶顶部第3片叶的中部位置是最佳的测量位点，主脉中部两侧SPAD值的平均值更能代表整个叶片的SPAD值水平。

SPAD值取决于叶片葉绿素对特定波段光线的吸收，在同一天中，随着光辐射照度的增强，测得的SPAD值会有降低趋势。本文研究了两个品种在一天中随着光辐射变化叶片SPAD值的变化趋势，发现一天中随着光照幅度增加，SPAD值出现降低趋势，这与陈防等[17]的研究结果一致。并且发现在8：00-10：00和12：00-14：00这两个时间段内测得的SPAD值比较稳定，综合考虑大田测量的可操作性、代表性等因素，选择8：00-10：00进行大田烟叶SPAD值的测定。

3.2 叶片清洁度

烤烟叶片清洁度对SPAD值测定结果的影响未见有相关报道。本研究发现，中烟100和豫烟9号两个品种叶片经酒精擦拭后，叶片的SPAD值出现显著的变化。生育前期（移栽后25 d）酒精擦拭叶片和测定窗口后SPAD值变化显著且幅度较大，生育中后期（移栽后70 d）叶片清洁后的SPAD值测定结果变化较小，整体趋势基本保持一致。其原因可能为烟叶叶片表面分布着大量的腺毛，叶片从幼叶到进入生理成熟期，叶片黏性物质分泌增多[18]，而分泌物对叶片表面具有覆盖作用，尤其在生育前期测量易受到农事操作和气候的影响，叶面往往附着物较多，因此烟叶叶片表面需经过酒精擦拭，剔除其他外界杂质获得的值更能代表叶片的真实值，所以在实践应用中，应使用酒精棉签擦拭测定窗口，如一次测量数据数较少可不擦。

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