有机磷农药废水高效降解菌的筛选及菌群构建

李铁军　丁邦琴　周春晓

摘要：利用有机磷农药废水培养基，从江苏省南通市有机磷农药生产企业污水处理池活性污泥中驯化、分离了52株具有有机磷农药废水降解能力的菌种，建立资源库。对菌种资源库进行高效有机磷农药废水降解菌的筛选，获得14株72 h COD去除率大于60%的菌株。经形态学观察和16S rDNA初步鉴定，10株细菌分属于假单胞菌属（Pesudomonas）、不动菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、副球菌属（Paracoccus）；4株真菌分属于丝孢酵母属（Trichosporon）、曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、青霉属（Piniciellum）。选择降解率高的5株菌进行组合培养，筛选了6组72 h COD去除率大于70%的高效降解有机磷农药废水的菌群组合。

关键词：有机磷农药废水；高效降解菌；菌群组合；筛选

中图分类号：X592 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）03-0019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.005

Abstract： Based on medium made of organic phosphorus pesticide wastewater，a resource library contains 52 strains with degrading ability of organophosphorus pesticide wastewater was set up， these strains were domesticated and isolated from activated sludge from sewage treatment tank of organophosphorus pesticide production enterprises in Nantong city，Jiangsu province. 14 strains with 72 h COD removal rate more than 60% were obtained by screening of highly efficient degradation strain from the library. Through morphological observation and 16S rDNA identification，10 strains of bacteria belong to Pseudomonas，Acinetobacter，Bacillus，and the genus Paracoccus，and 4 fungi were classified as Trichosporon，Aspergillus，Trichoderma and Penicillium. Finally，6 group of flora combination with 72 h COD removal rate more than 70% were selected by using 5 strains with high degradation rate.

Key words： organophosphorus pesticide wastewater； highly efficient degradation strain； flora combination； screening

有機磷农药是目前应用最广泛的农药，具有高效、经济、方便和广谱等优点。然而，有机磷农药生产和使用过程中产生的废水具有浓度高、毒性大、成分复杂等特点，如不进行有效处理， 将会严重破坏生态环境[1]。生物降解法是处理有机磷农药废水的有效方法之一，与传统的理化处理方法相比，具有节能减排、针对性强、无需增加设备、环保等优点[2]。生物降解法的原理是利用微生物的代谢将有机磷农药废水同化或分解，其核心是高效降解菌的筛选[3]。

近年来，国内外研究学者已报道分离的有机磷农药废水降解菌几乎包括细菌、真菌、放线菌、藻类等各种微生物，其中，细菌由于其生化上的多种适应能力以及易诱发突变菌株，在降解微生物中占重要地位[4]。虽然已有很多的高效菌被筛选、鉴定，相关的一些降解酶基因也已被克隆表达，高效工程菌株也多见报道，但是由于有机磷农药废水成分复杂，某种有害成分需多种微生物同时分解，同一种菌也会对多种类似结构成分具有降解作用[5]。已有研究表明，在自然环境中，微生物在降解有机污染物时，不同种群微生物间存在协同作用，复合菌株具有较好的环境适应性，降解效果常较单一菌株好[6]，但目前国内外尚未见利用复合菌株降解有机磷农药废水的相关报道。本试验针对目前有机磷农药废水生物处理研究和开发现状，通过不同水质有机磷农药生产废水优势降解菌种的筛选、分离、鉴定，以期获得对有机磷农药废水化学需氧量（COD）降解率高的菌株及混合菌群组合。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验废水及水质 试验用废水取自江苏省南通市某农药厂有机磷农药生产废水，原废水清亮透明，强酸性，有强烈的刺鼻气味，COD为156 000 mg/L，总磷含量为13 200 mg/L，BOD/COD<0.1，敌百虫有机磷农药残留量4.0%左右，NaCl含量5.34%。

1.1.2 菌株来源 活性污泥样品采自南通市某农药厂的污水处理池。

1.1.3 药品试剂 酵母提取物、蛋白胨为Oxide产品；PCR扩增试剂盒、DL 2000 Marker、p MD-18T 载体、T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品；DNA胶回收试剂盒（Omega）；氨苄青霉素、琼脂糖、X-gal，IPTG为Ameresco公司产品；其他药品均为国产分析纯。

1.1.4 仪器设备 DNA Thermol Cycler4800型PCR仪，AmpGene公司；3K18高速冷冻台式离心机，美国Sigma公司；迷你离心机，德国Eppendorf公司；DU 640紫外核酸蛋白质分析仪，美国Beckon公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；超净台，苏州净化仪器厂；THZ-C恒温振荡器，太仓市光明实验分析仪器厂；Power PAC300电泳仪，美国Bio Rad公司；恒温水浴锅，北京东方晶美科学仪器有限公司；Gene Pulse电转化仪与0.2 cm的石英电转杯，Bio-RAD公司；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂。

1.1.5 缓冲液及培养基 ①磷酸盐缓冲液。NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，加去离子水定容至1 L。②含20%、40%、60%、80%有机磷农药生产废水的无机盐培养基。K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，（NH4）2SO4 0.2 g，CaSO4 0.08 g，加含有机磷农药生产废水20%、40%、60%、80%的去离子水定容至1 L。③牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加pH 7.0左右的有機磷农药生产废水定容至1 L。④马铃薯培养基（培养真菌用）。去皮马铃薯200 g，蔗糖20 g，加有机磷农药生产废水定容至1 L。⑤高氏一号培养基（培养放线菌用）。可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，加有机磷农药生产废水定容至1 L。⑥活化培养基。蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，KH2PO4 1 g，加去离子水定容至1 L。⑦固体培养基。各液体培养基中添加20 g/L琼脂。以上缓冲液和培养基均需在121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 污泥预处理 将20 mL活性污泥放入100 mL烧杯中，沉降30 min，去上清液；将底层污泥分装到100 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min，弃离心管上清液；用60 mL灭过菌的磷酸盐缓冲液清洗离心管底部的泥，在上述条件下再次离心，如此操作两次，将活性污泥中的菌释放出来。

1.2.2 菌种驯化 采用逐渐提高有机磷农药生产废水浓度的方法对菌株进行驯化。洗泥后将离心管底部污泥取出，用灭过菌的50 mL无机盐培养基将其配成污泥溶液，充分混合均匀后，加到450 mL含20%有机磷农药生产废水的灭菌无机盐培养基中，28 ℃、200 r/min摇床振荡培养，5 d后从中移取50 mL培养液加到450 mL含40%有机磷农药生产废水的灭菌无机盐培养基中，28 ℃、200 r/min继续摇床振荡培养5 d；同样操作转接含60%、80%有机磷农药生产废水的灭菌无机盐培养基，获得驯化菌群。

1.2.3 菌种分离及资源库的构建 菌株分离采用梯度稀释涂布法，将驯化后的菌液稀释至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度，分别取200 μL各梯度稀释后的菌液涂布于对应的牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏一号培养基固体平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养，直至长出明显菌落。用接种环挑取形态不同的单菌落，对其进行划线纯化至新鲜固体平板中，重复纯化，直至获得纯的单菌落。将纯化的不同菌株转至相对应类型的斜面培养基中，在28 ℃恒温培养箱中培养，然后将其放入冰箱中4 ℃下保存，建立菌种资源库，以备使用。以后每月将菌种资源库中的各个菌株转种至相对应类型的新鲜斜面培养基中1次。

1.2.4 高效有机磷农药废水降解菌的筛选 ①废水预处理。向废水中加入5 g/L CaCO3（方解石，0.044 mm，325目）反应3 h，将废水pH调至7.0左右，CaCO3处理结束后过滤除去沉淀。②分别将分离的菌株扩大培养至菌浓度OD600 nm为0.5左右，与处理后的试验废水按体积比1∶2混合，置于250 mL锥形瓶中在 28 ℃、120 r/min摇床处理，分别取0、24、48、72、96、120 h的样品测定其COD，直至COD趋于稳定。试验中COD的检测采用重铬酸钾法[7]，参照GB 11914-1989。有机磷农药废水的COD去除率=（C0-Ct）/C0×100%，式中，C0为菌株培养前的废水COD浓度；Ct为菌株培养一定时间后的废水COD浓度。③设不接种菌种组在相同条件下摇床培养为空白对照，以COD去除率来表示筛选得到的菌株的降解能力，初筛出COD转化率相对较高的菌株（72 h COD去除率大于60%），保存至斜面以备用。

1.2.5 高COD去除率菌株的初步鉴定 菌株鉴定参照文献[8-10]；菌株16S/18S rDNA序列分析由上海生工生物工程股份有限公司进行。

1.2.6 高效有机磷农药废水降解菌群的构建 将筛选获得的具有高效降解有机磷农药废水的菌株分别进行2株菌、3株菌、4株菌等不同组合，等比例接种培养，构建不同的微生物降解菌群，检测其72 h COD 去除率，并通过与单菌株去除率的比对，研究不同菌群组合的降解效果，每个组合设置3次重复。

2 结果与分析

2.1 有机磷农药废水降解菌的分离纯化及资源库的构建

以试验废水为培养基，将从农药厂污水处理池中采集的活性污泥经过驯化、分离的52株具有有机磷农药废水降解能力的菌种建立资源库，其中含38株细菌、9株真菌、5株放线菌，对各菌株进行编号，斜面培养基4 ℃保存备用。

2.2 菌株筛选结果

取各菌株分别处理试验废水，72 h COD去除率大于60%的菌株有JSBL1、 JSBL5、 JSBL6、 JSBL8、 JSBL11、 JSBL12、 JSBL15、 JSBL17、 JSBL18、 JSBL22、JSBL35、JSBL47、JSBL48、JSBL50，经计算，各菌株对COD去除率的平均值为65.2%，各菌株对废水中COD的去除效果见图1，由图1可以看出，JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47菌株的72 h COD 去除率大于65%。

2.3 菌种鉴定结果

对筛选获得的14株菌株进行形态学观察和16S/18S rDNA序列分析鉴定，其中有10株细菌、4株真菌。

10株细菌菌株鉴定结果见表1。由表1可见，除JSBL17菌株为不动菌属（Acinetobacter）、JSBL47菌株为芽孢杆菌属（Bacillus）、JSBL50为副球菌属（Paracoccus）外，其余7株菌株均为假单胞菌属（Pesudomonas）。

4株真菌菌株鉴定结果见表2。由表2可见，JSBL6、JSBL8、JSBL22、JSBL48真菌菌株分属于丝孢酵母属（Trichosporon）、曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、青霉属（Piniciellum）。

2.4 高效有机磷农药废水降解菌群的构建

选72 h COD去除率大于65%的5个菌株JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47，分别进行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌组合，等比例接种培养，检测72 h COD去除率，通过与单菌株的降解率比对，各菌群组合的降解效果见表3。

由表3可以看出，不同菌株的菌群组合相对于单菌株而言，72 h COD去除率均升高的有JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL47、JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL17/JSBL35/JSBL47、JSBL5/JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL35/JSBL47，且這6组的72 h COD去除率均大于70%，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47组合72 h COD去除率最高，为75.8%；其余组合均有升有降，72 h COD去除率介于60.5%～69.3%。

3 小结与讨论

生物处理法处理农药废水的关键是筛选高效降解菌种，污泥驯化是获得适宜菌种的有效途径。迄今为止，已从石油、农药、油脂、苯酚、抗生素等废水的污泥中分离出多种高效降解微生物。本研究通过逐渐提高有机磷农药生产废水浓度的方法对菌株进行驯化，其目的在于获得对有机磷农药废水具有较高降解能力的高效菌株。经过筛选获得了14株72 h COD去除率大于60%的菌株，其中10株为细菌，4株为真菌；10株细菌菌株分属于假单胞菌属、不动菌属、芽孢杆菌属、副球菌属，4株真菌菌株分属于丝孢酵母属、曲霉属、木霉属、青霉属；此筛选结果与已有文献报道基本一致，分解有机磷农药及生产污水的微生物主要是细菌，也有一些真菌，其中假单胞菌属、芽孢杆菌属是最活跃的菌属，真菌以曲霉属为主[11]。

另外，由于有机磷农药废水成分复杂，依靠单一的微生物无法彻底完成有机磷农药废水的降解，需要通过具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能实现有机磷农药废水的完全降解[4]。本研究对筛选得到的72 h COD去除率大于65%的5个菌株分别进行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌混合，构建了26组降解有机磷农药废水的菌群组合。根据各菌群组合的降解率可以看出，不同菌株的菌群组合相对于单菌株而言，有的升高，有的降低，这可能是由于不同菌株之间的相互作用导致的。研究发现，6组混合菌群的降解效果均比单个菌株降解效果有明显提高，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47组合降解率达到75.8%。已有研究认为，复合菌中的相互共存菌种越多，抗冲击能力也就越强，这个菌群也就越稳定，因此，在实际中常采用多菌株复合降解体系，使其更贴近自然界微生物的协同生态关系[12]。本研究JSBL17/JSBL35/JSBL47组合中，3个菌株分属于假单胞菌属（Pesudomonas）、不动菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus），可能是3种细菌在代谢途径上存在互补性。

本研究只是对高效有机磷农药废水降解菌的筛选和组合进行了初步研究，后续研究中还将对高效降解菌株和菌群组合的降解机理及温度、pH、盐度、时间等对降解能力的影响进行进一步研究，以为高效有机磷农药废水降解菌的固定化研究奠定基础。

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