铅胁迫对舞毒蛾幼虫发育及解毒酶活性的影响1)

杨丽娜 王月月 孟昭军 严善春

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

铅是人、动物及植物的非必需生长元素。随着工农业的发展和汽车尾气的大量排放，铅通过大气沉降、污水灌溉等方式进入土壤并在土壤中富集[1-2]。林木能通过根部从土壤中吸收重金属，从而降低土壤中重金属的含量，在重金属污染防治方面具有明显的优势[3]。但金属在植物体内积累过多，会对植物产生毒害作用，使植物体内的代谢过程发生紊乱，直接影响植物生长发育，乃至造成植株死亡[4]。然而，根据元素防御假说，植物叶片中富集的重金属能对食叶昆虫产生直接的毒害作用，从而对昆虫的生长发育、生理生化、新陈代谢等方面产生不利的影响[5-6]。

为了抵御包括重金属在内的内外源有毒物质的毒害作用，昆虫在体内逐渐形成一套有效的解毒机制，如通过提高羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)等解毒酶的活性[7-8]。CarE主要通过代谢体内某些内源及外来有害物质，使其分解，排出体外，达到解毒的目的。GSTs参与、催化某些内源性或者外来有害物质的亲电子基团与还原性谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易排出体外，保护其机体、减少氧化压力[9-10]。CarE和GSTs能通过清除昆虫体内由重金属胁迫诱导产生的活性氧(ROS)，来帮助昆虫减弱重金属对其造成的氧化损伤。

舞毒蛾(Lymantriadispar)属鳞翅目毒蛾科(Lymantriidae)，是一种杂食性林木叶部害虫[11]。我国文献记载舞毒蛾可取食500余种植物，是我国森林、园林、蚕业、果树的重要害虫，给农林业经济发展带来严重的损失[12]。本研究通过用含Pb饲料饲喂舞毒蛾，研究其在Pb胁迫条件下的生长情况及其解毒酶活性变化，探究重金属胁迫对林木害虫发生趋势的影响，为重金属污染地区的林木虫害防治提供基础理论。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫处理

舞毒蛾卵块及幼虫人工饲料购于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，卵块已经低温刺激解除滞育。将卵块用75%乙醇浸泡10 s进行消毒后，用蒸馏水冲洗3次，放在滤纸上吸干水分，装入培养皿中。将培养皿放入人工气候箱(型号HPG-280HX、哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)中进行卵块孵化。待幼虫孵化后用人工饲料饲养至2龄，备用。

根据前期研究结果，在不同程度的Pb胁迫下，银中杨叶片中的Pb分别为33、43、48 mg·kg-1。将铅粉加入人工饲料，使不同处理组饲料中的Pb为33、43、48 mg·kg-1。将刚蜕皮、健康且个体发育大小一致的舞毒蛾2龄幼虫饥饿24 h后，依次接入各组饲料中进行饲养，每组每天换一次相应Pb质量分数的饲料，记录幼虫的生长发育情况，直至所有幼虫化蛹或死亡。每个处理设置3个重复，每个重复50头幼虫。放在人工气候箱中饲养，饲养条件均为温度(24±1)℃，相对湿度(60±1)%，光周期16L∶8D。在试验期间，从各组内分别选取蜕皮不超过24 h的3龄、4龄幼虫，饥饿24 h后置于冰箱中-80 ℃超低温备用。各组的标记代码为低、中、高，Pb质量分数分别为33、43、48 mg·kg-1。对照组为CK，不含Pb。

1.2 虫酶活性测定方法

1.2.1 酶源制备

CarE和GSTs的酶源制备方法相同。取舞毒蛾3龄幼虫，每4头为1个重复；4龄幼虫，每3头为1个重复。每处理设3次重复。将3龄、4龄幼虫分别置于预冷的玻璃匀浆器中，加入磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH=7)，冰浴条件下匀浆。所得匀浆液置于离心机中，10 000 r·min-1，4 ℃，离心20 min，取上清液做为酶源。

1.2.2 蛋白质质量测定

参照Bradford[13]的考马斯亮蓝G-250染色法对蛋白质质量进行提取和测定。重复测定3次。准确吸取测定溶液于试管中，往试管中分别加入5 mL考马斯亮蓝G-250，于25 ℃水浴锅中放置2 min，之后在595 nm下测定OD值，以牛血清蛋白质量为横坐标，以OD值为纵坐标制作标准曲线。

1.2.3 解毒酶活性测定

参照郭庆龙[14]、鲁艺芳[15]和鄢杰明[16]等的方法对CarE和GSTs进行提取和酶活测定。重复测定3次。

CarE酶活性测定：以5 mLα-醋酸萘酯为底物液，加入0.3 mL酶液，水浴振荡条件下反应30 min后，每只试管加入显色剂各1 mL，室温下静置30 min，用紫外分光光度计测定600 nm波长下的OD值。

GSTs酶活性测定：将2.5 mL磷酸缓冲液(pH=7)、0.2 mL谷胱甘肽和0.1 mL CDNB混合后，加入0.1 mL酶液，在25 ℃恒温水浴20 min。取出后用紫外分光光度计在340 nm波长下测5 min内OD变化值。

1.3 数据处理

GSTs酶活(nmol·mg-1·min-1)=(ΔOD340·V)/(ε·L·m)。

式中：ΔOD340表示340 nm处每分钟光吸收的变化值；V表示酶促反应体积；ε表示产物的消光系数0.009 6 L·μmol-1·cm-1；L表示比色杯的光程(1 cm);m表示酶液中蛋白质量(mg)。

CarE酶活(μmol·mg-1·min-1)=n/(m×t)。式中：n表示反应时间内酶水解α-乙酸萘酯底物生成的α-萘酚的量(μmol)；m表示酶液中蛋白质质量(mg)；t表示反应时间(min)。

1.4 数据分析

利用SPSS软件进行数据处理，采用one-way ANOVA进行差异显著性方差分析，以LSD(最小显著法)在0.05水平下检验各组之间数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 含Pb量胁迫对舞毒蛾幼虫死亡率的影响

取食不同含Pb量饲料后，舞毒蛾幼虫的死亡率、化蛹率、羽化率、雌雄比例见表1。各处理组舞毒蛾幼虫死亡率、雌雄比例增加，均显著高于CK(P<0.05)，化蛹率、羽化率均不同程度的低于CK，死亡率、雌雄比例随着饲料中Pb质量分数的升高而不同程度的升高；化蛹率、羽化率则降低，且Pb高、中质量分数显著低于Pb低质量分数和CK(P<0.05)。说明Pb胁迫能造成舞毒蛾幼虫死亡、雌雄比例增加，化蛹率、羽化率降低，且呈含量依赖性。

表1 Pb胁迫对舞毒蛾幼虫发育的影响

注：表中数据为平均值±标准误(n=3)。同列不同大写字母表示各处理间差异显著(P<0.05)。

2.2 含Pb量对幼虫体内CarE和GSTs活性的影响

取食不同含Pb量的饲料后，幼虫体内CarE和GSTs活性的变化与Pb的含量相关(表1)。由表2可知，与对照相比，Pb中质量分数处理组的3、4龄幼虫体内的CarE活性均显著增加(P<0.05)，GSTs活性也不同程度的升高。而Pb高质量分数处理组的3、4龄幼虫体内的CarE和GSTs活性不同程度的低于CK，且其中4龄幼虫体内的CarE活性与对照差异显著(P<0.05)。说明舞毒蛾幼虫在Pb质量分数低时，CarE和GSTs能积极响应解毒，但在Pb含量高时，CarE和GSTs的解毒能力明显受到抑制。

表2 Pb胁迫对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的的影响

注：表中数据为平均值±标准误(n=3)。同列不同大写字母表示同一龄期不同处理间差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

据研究报道，当昆虫在体内富集较高含量的重金属(如Pb、Cd、Zn等)时，会对其造成发育减缓、各龄幼虫体质量以及化蛹率降低、幼虫死亡率增加等不利影响[17-18]。本研究发现，随着Pb质量分数的增加，舞毒蛾幼虫死亡率增加，化蛹率、羽化率降低，雄性比例增加，其中Pb中、高质量分数处理组的死亡率、化蛹率、羽化率和雌雄比例均与对照差异显著(P<0.05)。说明Pb胁迫能对舞毒蛾幼虫产生显著的毒害作用。

昆虫在外源有毒物质进入体内时，需要经过氧化、还原、水解等多种方式解毒，这些过程需要昆虫体内重要的解毒酶体系如羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶，在不同时间、不同组织内参与，共同完成对有毒物质的解毒代谢[19-20]。本研究发现，Pb中质量分数组中舞毒蛾3、4龄幼虫CarE活性均显著增加(P<0.05)，GSTs活性也不同程度的升高；Pb高质量分数组3、4龄幼虫的CarE和GSTs活性均不同程度降低，其中4龄幼虫的CarE活性降低显著(P<0.05)。说明舞毒蛾幼虫在低含量Pb胁迫下，会产生一种“毒物兴奋效应”，刺激其提高体内的CarE和GSTs活性来响应对Pb的解毒；但随着Pb胁迫质量分数的升高及胁迫时间的延长，舞毒蛾幼虫会产生一种“毒物抑制效应”，抑制解毒酶的活性。Sun et al.[21]研究发现低含量镍能激活斜纹夜蛾(Prodenialitura(Fabricius))幼虫体内的CarE酶活性，而高度浓却使该酶活性受到抑制。张凯等[22]研究发现取食含有高含量Cu或Cd的树叶之后，舞毒蛾幼虫体内GSTs活性显著下降。这些研究结果与本研究结果一致，说明昆虫体内的解毒酶系对重金属胁迫的响应趋势与胁迫时间及胁迫浓度密切相关。

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