piRNA通路在生精过程中的作用

李雪瑶，杨菁，李洁，徐玲

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

夫妻正常无保护性性生活同居一年未孕为不孕症或不育症，全球约10%～15%的夫妻受此困扰，男性因素不孕与女性因素不孕几乎各占一半。全球有约5%的男性有不育症，随着研究的深入，越来越多的因素被证明与男性不育相关，生精过程极为复杂，任一环节的障碍都可以导致男性不育。本文主要讨论piRNA通路在生精过程中的作用。

一、piRNA简介

非编码RNA(non-coding RNA)是一类通常被认为不能编码蛋白质的RNA，包括小分子非编码RNA(small non-coding RNA，sncRNA)与长链非编码RNA(long non-coding RNA，licRNA)。小分子非编码RNA又包括siRNA(small interfering RNA)、snoRNA(small nucleolar RNA)、miRNA(micro RNA)、tRNA(transfer RNA)以及piRNA(piwi-interacting RNA)等。piRNAs是一类与Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白特异性结合的非编码小RNA，它们与PIWI蛋白结合后，形成piRNA沉默复合体(piRNA-induced silencing complex，piRISC)在干细胞、肿瘤等的发生发展中起着重要作用，特别是在生殖系统。

1. piRNA的发现与合成：piRNA是一类由Vagin等[1]最先从小鼠、大鼠的生殖细胞中分离得到的长约26～31 nt的sncRNA，因与PIWI蛋白家族成员特异性结合，称之为PIWI-interacting RNA，即piRNA。目前在人类基因组中已发现24 000个以上piRNA序列[2]。最近有学者发现，在牛的卵泡池与合子池中存在大量与piRNA类似但是稍短(24～27 nt)的RNA，而且表现出经典的piRNA特征，称之为pilRNA[3]。

与miRNA、siRNA不同，piRNA的生成不需要Dicer酶的存在，但Squash与Zucchini两种核酸酶的基因突变后piRNA的合成受到影响，推测可能与这两种酶有关[4]。编码piRNA的基因呈高度不连续簇状分布，因此被称为piRNA基因簇，分单链簇或双链簇，单链簇直接以本体为模板产生piRNA，主要存在于体细胞中；双链簇则需要乒乓循环机制，产生正义piRNA与反义piRNA，是生殖细胞piRNA合成的主要模式[5]。piRNA簇由RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RNA pol II)转录，双链piRNA簇由一种基因沉默与染色质形成中的标志物H3K9me3标记[6]。

最广为接受的piRNA扩增模型为乒乓循环模型(ping-pong model)，即扩增模型，又称二次加工，解释了piRNA从其前体循环增生，由Aubergine(Aub)与Ago3二者参与剪切[5]，主要为Aub蛋白与反义链piRNA结合后，通过碱基互补配对形成次级piRNA(正义链piRNA)前体，由具有Slicer活性的Aub进行剪切形成次级piRNA，次级piRNA与Ago3蛋白结合，以此为模板，再合成并形成反义链piRNA前体，剪切产生成熟反义链piRNA，再与Aub蛋白结合，如此循环往复。Zhou等[7]发现，小鼠睾丸生精细胞减数分裂粗线期产生的核蛋白BTBD18，点状分布于细胞核内，通过促进RNA polymerase II的转录延伸调节小鼠piRNA簇，在沉默了BTBD18后，小鼠的piRNA合成以及生精过程受到影响，导致雄性不育。Wasik等[8]发现一种TURDs蛋白RNF17可抑制次级piRNA的扩增，从而引发小鼠不育。

还有一种途径为初级加工途径，线粒体外膜蛋白GPAT2通过与Mili结合参与初级piRNA的合成[9]。MitoPLD被认为参与了piRNA 5’末端甚至3’末端的加工成熟[10]，洪叶挺[11]发现，弱精症、无精症患者精浆中piRNA的种类和含量较正常男性明显减少，并且伴有MitoPLD蛋白表达的下降，而MitoPLD缺失突变的小鼠生精过程被阻滞在减数分裂偶线期，他们推测MitoPLD蛋白可影响piRNA的形成，并且他们通过电镜证明，精浆piRNA大部分存在于Exosome中。piRNA的5’末端具有很强的尿嘧啶偏向性，3’末端被2’-O-Me修饰，以免受核酸外切酶降解[12]。

2. PIWI蛋白：果蝇体内发现有5种不同的Argonaute蛋白(Ago1、Ago2、Ago3、Piwi和Aub)，其中Ago3与Aub同属于PIWI亚家族，具剪切活性。哺乳动物体内发现有Miwi/Piwi、Mili/Piwi2和Miwi2/Piwil4 3种PIWI亚家族，人类已经确定的有Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4四种PIWI亚家族[13]。piRNA主要通过piRISC即piRNA通路在哺乳动物精子形成中发挥重要作用，缺少PIWI蛋白的动物表现为雄性不育。比如，小鼠敲除Miwi、Mili或Miwi2基因后，精子表现出明显缺陷[14]，敲除了雌性小鼠Mili基因后，几乎所有piRNA都消失了，并且伴有反转录转座子的大量表达，而敲除Miwi后对其影响较小[15]，说明Piwi蛋白的异常表达，主要对男性生精功能造成影响。

PIWI蛋白的表达具有时间与空间上的差异[16]。小鼠体内的Mili蛋白主要存在细胞质中，特别是细胞核周围的nuage中[17]，在生殖干细胞时期开始表达，在精原干细胞进行有丝分裂的细线前期与细线期明显减少，在减数分裂偶线期开始表达增多，在减数分裂粗线期达到高峰；Miwi蛋白主要在核糖核蛋白和多聚核糖体上表达，主要出现在减数分裂粗线期直至早期圆形精子细胞时期，之后将被泛素化修饰清除[18]；Miwi2则表达于减数分裂的粗线前期细胞核上，呈一过性，但是Miwi2蛋白的突变会导致唯支持细胞综合征(Sertoli cell only syndrome，SCOS)[19]。

二、piRNA通路在生精过程中的作用

1.抑制转座子：piRNA下游通路蛋白Exonuclease domain-containing1(EXD1)和CG9754可以抑制转座子活化、激活转座子高甲基化及促进转录沉默[20]。TDRD12是Tudor结构域家族(Tudor domain containing)成员，EXD1是TDRD12的一个重要组成部分，在睾丸中表达水平最高[21]，作为下游通路蛋白，可以辅助调节piRNA抑制转座子转座的发生；缺乏EXD1会引起反转录转座子的增多以及活化转座子。研究发现，CG9754是转座子抑制和转录沉默中重要的piRNA通路蛋白，CG9754同RNA或DNA的结合可以引起有效的转录沉默。很多证据表明，转座子的调控与生精过程密切相关，主要促进宿主基因组产生重要的物质来保护遗传信息，在动物模型中，如果该动物中PIWI通路异常，则表现为雄性不育，这也进一步证实了该通路与生精过程相关[22-23]。有学者发现，Mili通过切割细胞质内靶RNA来阻止piRNA与细胞核内Miwi2结合，Mili剪切后产生一个piRNA前体的中间体，该中间体转化加工为piRNA依靠MVH(Mouse Vasa Homolog)的ATP酶活性，以此来保证转座子的沉默与维持雄性生育力，而TDRD9的ATP酶活性对于piRNA的生物合成是不必要的，但是对于转座子的沉默与男性生育力的维持却是必不可少的[24]。另有实验证明，Cbp80参与piRNA的合成，敲低小鼠的Cbp80后发现Piwi、Aub、Ago3蛋白下降以及定位的改变，并伴有转座子的上调[25]。

2.介导泛素化降解：Gou等[18]发现介导Piwi蛋白泛素化降解的关键元件D-box(Destruction box)的杂合突变会导致患者弱精症、甚至无精症，通过将Piwi(Miwi)杂合突变敲入小鼠进行建模验证，发现Miwi/D-box杂合突变小鼠均出现雄性不育，其生精过程停滞在延长型精子细胞阶段，仅部分小鼠可产生少量形态异常的精子，与这些患者表型一致。正常情况下，组蛋白泛素连接酶RNF8与Miwi蛋白以不依赖piRNA的方式相互作用，Miwi蛋白将在晚期精子细胞中被泛素连接酶介导的泛素化通路降解，使RNF8进入细胞核泛素化修饰组蛋白，启动组蛋白-鱼精蛋白交换。而在这些杂合突变的小鼠中，Miwi在晚期精子细胞的细胞质中与RNF8稳定螯合、持续存在，造成本应进入细胞核的RNF8继续留在细胞质，因此抑制了组蛋白的修饰及组蛋白-鱼精蛋白交换的启动，导致组蛋白大量滞留，最终造成严重的雄性不育；但是将RNF8-N端多肽导入精子细胞可提高精子数量与质量、改善精子形态，可能是因为破坏RNF8与Miwi蛋白的稳定螯合作用而恢复了组蛋白-鱼精蛋白交换功能，提示这一策略或可有效治疗少弱精症、无精症、畸精症。

3.调控mRNA的表达：有学者认为，Miwi-piRNA与脱腺苷酸酶CAF1形成复合体后，可通过与靶mRNA不完全互补配对，从而诱发靶mRNA脱腺苷酸酶而降解[23]。MEAL是一种piRNA通路中的保守的蛋白免疫复合物，学者发现，在MEAL129无效突变小鼠的睾丸中，piRNA的表达下降，合并有编码鞭毛蛋白与翻译顶体蛋白等有蛋白翻译及编码功能的mRNA的下降[26]。Zhang等[27]研究小鼠睾丸中裂解的mRNA碎片，并对比小鼠球形精子期的研究后提出新的观点，认为Mili与piRNA结合后可通过碱基互补配对识别并结合靶mRNA，并直接切割与piRNA结合的mRNA，导致mRNA剪切片段的富集，而在Miwi催化区域丧失后，mRNA剪切片段富集程度明显下降。因此，piRNA对mRNA的调控主要体现在对靶mRNA的降解作用与剪切作用两方面。

4.基因甲基化修饰：CpG岛是指DNA中胞嘧啶C与鸟嘌呤G含量很高的区域，靠近启动子，CpG岛超甲基化抑制基因的表达，低甲基化则促进基因的表达。有学者对比了男性不育患者与正常对照男性的血液样本中471个CpG岛，揭示了Piwil 1与Piwil 2蛋白等位基因特异性的DNA甲基化的差异，说明ENO1、MTA2、BRSK2与LBX2等等位基因不同程度的甲基化参与了piRNA的作用，并干扰生精过程[28]。特别是一项在动物中的研究显示[29]，ENO1通过编码的酶活性调控相关蛋白的表达，该蛋白表达的升高伴随着公牛生育力升高，因此其蛋白表达被认为是男性生殖能力评估的一种全新标志物。

5. 染色质重塑：精子形成过程中因体积的急剧变小，导致染色质极度浓缩重塑，DNA片段折叠增多。精子细胞阶段，通过组蛋白H4的高度乙酰化，大部分组蛋白被鱼精蛋白替换，进一步提高DNA的压缩程度与安全性。而上述组蛋白与鱼精蛋白的交换过程需要Miwi蛋白的晚期降解，若Miwi蛋白发生障碍或功能异常，则导致组蛋白与鱼精蛋白交换障碍，导致细胞核结构疏松，严重影响染色质压缩的安全性以及基因组DNA的稳定性，并影响甚至阻滞染色质重塑，导致雄性不育。因此，piRNA通路在染色质重塑中异常重要[18]。

三、piRNA的其他作用

1. 肿瘤的发生发展：有研究发现，PIWI和piRNA的表达水平与肿瘤类型及分期密切相关。在肿瘤进展中，Piwil 1、Piwil 2、Piwil 3和Piwil 4四种蛋白随着临床分期的增加，下降趋势愈发明显，这可能提示PIWI蛋白可以扰乱肿瘤细胞的增值，影响肿瘤细胞凋亡，其降低则导致肿瘤细胞侵袭与转移，因此检测PIWI蛋白表达或具有全新的预测价值。FOXO4属于forkhead box基因家族，参与细胞增殖、凋亡等重要的细胞生物学过程，主要功能有抑制肿瘤细胞的增殖及转移。有研究发现，GAS5(growth arrest-specific transcript 5)来源的piRNA能上调FOXO4基因及TRAIL的表达，从而抑制乳腺癌细胞的生长，同时通过上调vimentin来抑制肿瘤转移[30]。Akkouche等[31]发现，膀胱癌患者体内piRNA有部分表达上调，部分表达下调。

2. 卵巢中的作用：有研究发现，果蝇胚胎中短暂的Piwi蛋白的降低，将导致卵巢piRNA簇中的H3K9me3减少，并导致卵巢piRNA的生物合成受到影响，因此导致转座元件转录产物的累积，最终导致雌性不育；而Piwi在后期发育阶段的减少并不影响到piRNA簇，这可能意味着在胚胎发育期间，piRNA簇以Piwi依赖的方式进行表观遗传[32]。

3. 其他：MAEL被发现在粗线期piRNA的生物合成和维持不可或缺，主要体现在MAEL通过它的HMG-box(high mobility group box)蛋白与piRNA前体结合并协助其穿过核孔聚集到nuage[17]，MAEL突变基因的小鼠出现顶体与鞭毛异常[26]。PiRNA-3878的过表达被发现与库蚊的拟除虫菊酯抗性有关，下调其靶标CpCYP307B1的表达后蚊虫死亡率上升[33]。有研究发现[34]，snoRNA衍生和C/D-box保守的piRNA在人原代CD4 T淋巴细胞中极为丰富，而piRNA(piR30840)可通过完全互补配对与pre-mRNA内含子结合，显著下调白细胞介素-4(IL-4)，并因此抑制Th2淋巴细胞的发育，这可能成为过敏治疗的新靶标。

四、总结和展望

随着研究的深入，发现piRNA以多种不同机制参与生精过程的调控，甚至可能与种族、男性不育类型等有关。有报道发现，在印度梗阻性无精症患者与正常生育人群中rs508485基因多态性无明显差异[35]，而中国人群中的研究结果与此相反，rs508485与rs77559927基因多态性可诱发精子发生缺陷，增加无精症的风险[36-37]。所以，piRNA的研究可能需要考虑到种族差异、表观遗传学、男性不育类型等，以及更大规模的研究。Hong等[38]发现，在精浆中piRNA水平从正常男性、少弱精症，到无精症患者逐步降低，而且piRNA水平与精子活力正相关，而且已经确定精浆中5种piRNA与不育相关；李洁等[39]发现，随着男性精子核DNA碎片指数的升高，piRNA-013423与piRNA023386有所下降，说明piRNA可能与精子核DNA的完整性有关系。虽然具体机制不明，但是这些都说明精浆piRNA可作为男性不育的特异性非侵入性生物标志物，为评价男性生育力提供新的途径与方法。Gou等[18]虽然发现了控制Piwi蛋白泛素化修饰降解的关键元件D-box，并在小鼠体内得以验证和治疗，但是筛查了413例无精症、弱精症患者仅有3例为Miwi/D-box杂合突变，说明生精过程极为复杂，其他通路导致的生精障碍仍值得探讨与研究，但是也说明有些类型的男性不育是有可能可以克服或者逆转的。而且既然与男性不育密切相关，也是否意味着给男性避孕提供了新的思路与方法？

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