稳定同位素技术 在蜂蜜真实性溯源中的研究进展

佘 僧,李 熠,宋洪波,陈兰珍,*

(1.福建农林大学,福建福州 350002; 2.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093 3.农业部蜂产品质量安全控制重点实验室，北京 100093 4.农业部蜂产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100093)

蜂蜜是蜜蜂通过口器吸取植物蜜腺中的花蜜或其他甜味分泌物,存入自身蜜囊携带回蜂巢中储存,经过一周时间,在内勤蜂的吞吐中酿制成熟[1]。主要营养成分有糖、氨基酸、矿物质,挥发性酸、维生素及各种活性酶等[2]。蜂蜜医药价值有大量文料记载。《本草纲目》中蜂蜜注解有清热、补中、解毒、润燥四大医药功效。现代医学研究发现,适当食用蜂蜜可以防治胃肠道[3]、咽喉等疾病[4],改善睡眠质量[5],治疗感染性创伤[6],以及美容养颜等[7]。蜂蜜对于改善食品色泽、口感和香味也有显著效果,由此蜂蜜加工制品也不断增多如蜂蜜蛋糕、蜂蜜酒[8]等。蜂蜜医药、感官、加工等优势,使得其需求量不断升高。中国海关统计公布的2013～2015年进口蜂蜜量分别为4856.7、5791.1、6520.7 t[9]。市场需求量增多的同时往往也伴随着蜂蜜真实性质量安全的弊端。深圳市消委会网络公布的2016年蜂蜜比较实验一阶段报告中指出:购买的60款蜂蜜中一款被检出外源C4植物糖浆掺假量超过51.7%。蜂蜜造假新闻的层出不穷,严重损害蜂蜜市场秩序的同时也给消费者健康埋下安全隐患。

同时,人们生活水平的提升生活质量标准也随之改变。消费者对于产品的品种类别、产地来源和名优品牌关注度逐渐增高[10]。假冒那些具有三品一标标识产品、以次充优等欺骗消费者的现象使得产品的产地和品种溯源研究成为食品质量安全控制中的重要内容。目前,用于蜂蜜真实性溯源研究的主要研究技术包括稳定同位素技术、红外光谱技术、液质联用技术、气质联用技术、核磁共振技术、DNA技术等。本文主要阐述稳定同位素技术在蜂蜜研究中取得的研究成果以及分析总结该技术的优势与不足,为推进稳定同位素技术在蜂蜜中的研究方向提供参考。

1 稳定同位素技术的简介

自然界中的生物和非生物都是由化学元素组成。具有相同质子数,不同中子数的同一元素的不同核素互为同位素。同位素根据稳定性分为放射性同位素和稳定同位素两大类。稳定同位素是指元素中原子序数相同,原子质量不同,化学性质基本相同,且半衰期大于1015年的同位素。稳定同位素比值是指同一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度比率,一般以字母R表示[11]。目前常用于食品研究应用中的稳定同位素比率主要有2H/1H、13C/12C、15N/14N、18O/16O、34S/32S、30Si/28Si、208Pb/206Pb。稳定同位素技术的原理是指通过基于电磁学原理设计而成的质谱仪,将被分析的稳定同位素由原子转化为离子状态,测定该元素的质荷比从而获得R样本值。为了便于实际应用,一般选择分析稳定同位素比值,即样品某元素的稳定同位素比率与国际标准品稳定同位素比率之间的比值,以符号(δ)表示[12]。因为,生物体在同外界环境进行物质交换(如呼吸作用、蒸腾作用、营养吸收等)将直接影响生物体内代谢过程,生物体内不同元素的稳定同位素比值也随之发生改变,该过程也被称为同位素自然分馏效应。外界环境中的季风气候种类、地质肥沃程度,经纬度、降水量、物质含量差异、生物体代谢方式等都将对生物体物质交换产生影响,因此,同位素比值也具有鲜明的地域种属特征,例如距离海洋越近的地域中δ32S值越高,C3植物的δ13C值明显低于C4植物,人工施肥下作物的δ15N值高于未施肥作物。稳定同位素经自然分馏作用后稳定同位素的组成与丰度确定了生物体独特的稳定同位素标识,因为该特征具有鲜明的地域、环境种属等自然特征性,因此也被称为“自然指纹”[13]。根据“自然指纹”的独特性便可实现对物质的追踪、溯源、研究、分析[14]。此外,生物体内稳定同位素的种类及分布状态随加工、贮藏等变化的幅度很小,较其他研究技术具有良好的稳定性,可真实准确的还原出食品原料的组成成分,耕作方式,种植环境[15]。鉴于稳定同位素技术的精确性和稳定性,该技术被广泛应用于食品掺假检测、动植物食品产地溯源鉴定、食品品种鉴别，例如果汁[16]、橄榄油[17]、小麦[18]、牛肉[19]、蜂蜜[20]等食品质量安全研究。

2 稳定同位素技术在蜂蜜中的研究进展

2.1 稳定同位素技术在蜂蜜掺假鉴别的研究进展

1971年,Bender等发现植物不同光合作用途径的稳定碳同位素具有生物歧视效应,13C/12C出现可检测到的信号差异[21]。1977年,W. White进一步研究得出:C3、C4、CAM植物的δ13C 范围分别是-22‰～-28‰,-10‰～-31‰,确立了外源C4糖浆添加量小于7%时,蜂蜜中蜂蜜蛋白与蜂蜜满足δ13C蜂蜜蛋白-δ13C蜂蜜<-1‰的相关关系[22-24]。1995年,基于W. White的研究成果,AOAC建立SCIRA(stable carbon isotope ratio analysis)方法检测蜂蜜外源C4糖浆掺假的国际标准AOAC978.17[12]。该方法中注明:掺假量%=(δ13C蜂蜜蛋白-δ13C蜂蜜)/(δ13C蜂蜜蛋白-δ13C玉米糖浆),且掺假量大于7%时可判定为掺假蜂蜜。2002年,中国建立蜂蜜的国家标准《GB/T18932.1-2002蜂蜜中C4植物糖含量测定方法-稳定碳同位素比率法》[25]。IRMS(isotope ratio mass spectrometer)技术在蜂蜜的真实性研究逐渐深入和全面。Cengiz等[26]通过土耳其安塔利亚13个蜂蜜样本对IRMS技术的敏感度、精确度等数据真实性进行实验验证。该研究结果得出,IRMS技术检测蜂蜜中C4糖含量的最低检测限、最低检测量、实验室内部标准回收率,分别为0.11%、0.38%、98.57%。Simsek等[27]利用IRMS技术对土耳其31个原蜜样本以及43个商品蜜样本进行检测,结果显示,31个原蜜样本属于纯蜂蜜,商品蜜检出掺假率为23%。Berriel等[28]首次利用IRMS技术对乌拉圭两个地区的51个蜂蜜样本进行分析,结果显示,8%存在蜂蜜外源C4糖浆掺假。luo等[29]利用EA-IRMS(element analysis-isotope ratio mass spectrometer)技术对58个中国商品蜜进行分析,发现有23个商品蜜存在掺假。

IRMS技术具有良好的的精确度和准确度,在鉴别蜂蜜中C4植物外源糖浆掺假方面获得很好的效果。但是,针对目前新的掺假技术如对蜜蜂饲喂糖浆增高产量,外源C3植物糖浆掺假如甜菜糖浆,IRMS技术无法实现准确检出。Gule等[30]利用IRMS技术对饲喂蜜蜂不同浓度糖浆生产的蜂蜜进行检测分析。检测方法包括AOAC 978.17,1995[31]AOAC991.41,1995[32]AOAC998.12,2005[33];检测指标包括:δ13C蜂蜜、δ13C蜂蜜蛋白、C4糖含量。研究结果显示,蜂蜜饲喂糖浆量高于20 L/群以及低剂量饲喂C4植物糖浆能准确检出,但对于甜菜糖浆饲喂量低于5 L/群时,无法检出。MartíN等[34]通过对15种蜂蜜共计49个样本进行分析,研究发现,使用半乳糖氧化酶反应处理蜂蜜中的低聚糖或添加小于7%的玉米糖浆都可以使蜂蜜中的δ13C处于正常值范围。Rogers等[35]利用IRMS技术测定新西兰1023个纯蜂蜜样本的δ13C蜂蜜、δ13C蜂蜜蛋白、C4糖含量。检出333个蜂蜜样本C4糖含量超过7%,其中麦卢卡蜂蜜占324个,错判率97.2%。麦卢卡蜜中甲基乙二醛含量超过250 mg/kg或者抗氧化活性>10+时,AOAC 998.12方法发生误判。

针对IRMS技术的不足之处,不同技术的联用开始作为检测技术研究的热点,如NMR-IRMS(Nuclear Magnetic Resonance and isotope ratio mass sepctormeter),LC-IRMS(liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry)等。Cotte等[36]利用IRMS和NMR联用技术研究蜂蜜的真实性。研究发现,IRMS对于蜂蜜的掺假优于NMR,而NMR对于部分单花蜜的品种鉴别效果略优于IRMS。测定蜂蜜中单糖、二糖的碳同位素比值成为研究的新思路[37]。Cabaero等[38]利用LC-IRMS技术测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值,发现三者之间呈现一定的线性关系,外添加的糖浆含量在1%～10%之间将改变纯蜂蜜中单糖所存在的线性关系。Hao等[39]利用LC-IRMS和EA-IRMS技术分别对800个商品蜜进行分析研究。研究发现:掺假率计算值在-7

IRMS与不同技术的联用对于解决蜂蜜中甜菜掺假、蜜蜂糖浆饲喂等真实性问题的研究仍存有误判、错判现象。随着LC-IRMS对于蜂蜜中单糖研究的逐步深入,蜂蜜中的单糖含量变化范围的相关关系以及特征性变化区间等新的关于稳定同位素技术研究思路,将为IRMS技术在蜂蜜的真实性研究中带来突破性发现。

2.2 稳定同位素技术在蜂蜜产地溯源中的研究进展

食品溯源起源于1986年欧洲疯牛病爆发后的食品安全控制应急措施。2002年美国提出农田到餐桌的风险管理,溯源机制成为食品质量安全的重要内容。2008年我国发布《农产品地理标志管理办法》,并设立无公害食品、绿色食品、有机食品和地理标志农产品(三品一标)[40]。具有三品一标标识的特色名优产品从申请审核到最终获得认证,需通过专业研究人员的实地考核以及层层评审。对于蜂蜜而言,特色品牌的蜜源地一般属于自然环境极为优越,如我国湖北神农架林区的神农百花蜜,湖北黄陂区的黄陂荆蜜,湖北枝江市的枝江蜂蜜属于典型具有国家地理标识的蜂蜜品牌。名优品牌的知名度、售价远远高于普通蜂蜜品牌。在利益诱惑驱使下,少数商家采取伪冒名优品牌的欺骗性行为售卖给消费者掺假蜂蜜或者普通产区的蜂蜜,这严重破坏公平、公正的市场规则。产地溯源由此成为应急性安全控制之外产品质量控制的一项重要研究技术。

产地溯源技术各有优劣,稳定同位素技术对于蜂蜜产地溯源的研究应用都取得不错的成果,而且对于地理自然环境差异较大的蜂蜜产地溯源效果显著。Antje等[41]利用IRMS技术测定欧洲20个地区516个样本的C、N、H、S稳定同位素比值,七个地区的地域鉴别度超过70%。产地鉴别中气候条件、地质环境相似度越小,IRMS技术的识别度越高。Chesson等[42]利用IRMS技术测定蜂蜜和蜂蜡的δ2H值,发现在糖和水蒸气等物质的氢原子交换作用下,两者具有δ2Hhoney=0.9δ2Hwax+170%(R2=0.9000)的线性关系。而通过对采样地点湿度的记录,蜂蜡δ2H值与年降水量、地表水的δ2H值呈显著相关性。通过测定蜂蜡δ2H值可得知蜂蜜的地理来源,从而实现产地鉴别。Dinca等[43]利用NMR和IRMS技术对来自罗马尼亚、意大利、塞浦路斯、希腊、巴西和俄罗斯蜂蜜进行研究。虽然所选采样地点存在气候条件、温湿度等自然环境条件的显著差异。但两项技术单独使用时,均无法实现准确的地域判别。而两者连用并通过主成分分析法判别成功率高达99.85%。陈辉等[44]利用ICP-MS与IRMS技术连用测定中国不同产地来源的253个蜂蜜样本的44个微量元素指标以及C、N、H、O、S五个稳定同位素指标,并通过人工神经网络方法进行分析研究。结果显示,洋槐蜜、荆条蜜和所有蜂蜜的地理来源判别准确率分别为90%、95%和96%。Kropf等[45]利用TXRF(total reflection X-ray fluorescence spectrometry)和IRMS技术对斯洛文尼亚刺槐蜜、椴树蜜、栗树蜜三种花蜜不同地域的122个蜂蜜样本,并通过主成分分析法进行研究分析。结果显示,阿尔卑斯山、迪纳里克、潘诺尼亚、地中海四个存在显著气候环境差异的椴树蜜地域识别率为100%,刺槐和栗树蜜产识别率分别为98.2%和94.6%。

2.3 稳定同位素技术在蜂蜜品种鉴别中的研究进展

蜂蜜的品种按照蜜源种类可分为单花蜜和百花蜜两个大类别。一般在未出现大片单一植物蜜源时,蜜蜂采集多种植物花蜜酿制的蜂蜜都称为百花蜜。单花蜜要求蜜蜂采集花蜜的植物蜜源属于同一种植物。单花蜜的命名一般根据其蜜源植物来确定,如荆条蜜、椴树蜜、荔枝蜜、洋槐蜜。相对而言,单花蜜因为蜜源植物的单一,口感、色泽、香味等都有一定的特征性。如洋槐蜜的香味醇厚、口感润滑颜色为浅琥珀色,枣花蜜回味有辛辣感、颜色为深琥珀色。同时,蜜源植物生存条件的适应度等原因不同单花蜜的产量也有所不同。如中国由南至北、从东到西,地理、地质、气候、温湿度等环境条件变化显著。油菜喜冷凉、耐寒、分布广、跨越时间长,油菜蜜产量属于中国所有单花蜜产量中最高。而椴树一般耐寒、喜湿,多集中于东北地区,开花时间以及蜜源地的限制使得椴树蜜的产量远低于荆条蜜、油菜蜜等大蜜源的单花蜜品种。因此,不同植物来源蜂蜜的价格与产量存在较大差异,而部分不法商家惯用低价值的单花蜜冒充高价值的单花蜜,以获取更高的利润。

随着人们对于蜂蜜品种的关注度增高,品种鉴别也成为蜂蜜研究的重要内容。由于蜂蜜中蛋白质、糖、矿物元素等营养物质基本上来自于蜜源植物,不同植物与环境中物质交换的能力各不相同,且不同蜂蜜对于从蜜源植物中获取的营养物质成分含量的各有高低,因此,同一种元素的稳定同位素的相对丰度存在一定差异。Dinca等[43]利用NMR和IRMS技术对罗马尼亚不同植物蜜源的40个蜂蜜样本测定δ13C、δ2H、δ18O、D/H值。结果显示,罗马尼亚单花蜜的δ13C变化范围较小,洋槐蜜、油菜蜜、山花蜜的δ13C变化范围分别是:-22.34‰～-24.23‰、-25.02‰～-26.22‰、-23.26‰～-26.33‰,而椴树蜜δ13C的差值范围最小在-24.05‰～-24.99‰之间。IRMS可以准确区别油菜蜜,而NMR能够区分椴树蜜与洋槐蜜。Karabagias等[46]利用IRMS和ICP-OES(inductively coupled plasma optical-emission spectroscopy)技术测定2011～2013年24个来自于希腊不同植物蜜源的蜂蜜样本。百里香蜜、松花蜜、冷杉蜜、柑橘蜜的δ13C分别是(-24.87‰±0.68‰)、(-25.62‰±0.38‰)、(-26.37‰±0.18‰)以及(-25.49‰±0.70‰)。并通过主成分分析法,品种鉴别准确率可达到87.5%。Wu等[47]利用IRMS和ICP-MS技术对中国荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜、油菜蜜四种主蜜源组成的57个蜂蜜样本进行测定,并通过主成分分析法进行数据分析。研究得出,不同品种蜂蜜的δ13C、δ13H、δ13O值存在明显的差异,δ13H较δ13C能更有效的区分这四种不同品种的蜂蜜,四种蜂蜜的品种鉴别率接近100%。

2.4 其他

稳定同位素技术不仅在蜂蜜掺假、产地以及品种鉴别方面有较多的研究,而且在蜂蜜储存年限、人工饲喂影响方面也有所报道,胡柳花等[48]利用EA-IRMS技术研究了百花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜储存2年内的δ13C值变化,研究发现,三种蜂蜜储存2年后,δ13C值基本稳定。其次,关于人工饲喂的蜜蜂所酿造的蜂蜜与野生蜜蜂所酿造蜂蜜两者之间的差异,也有学者通过IRMS技术进行一定的研究。Lucy等[49]利用IRMS技术对人工饲养蜜蜂与野生蜜蜂所产的蜂蜜进行分析,从群体遗传学、寄生传播、传粉、种间相互作用和蜜蜂育种五个方面探究两种方式下所产蜂蜜的差别。其研究结果发现,人工饲喂和非人工饲喂之间的碳稳定同位素值具有明显差异。

3 结语

IRMS技术在蜂蜜的真实性溯源研究中具有显著的成果。如碳稳定同位素技术在蜂蜜中外源C4糖浆掺假鉴别已得到广泛应用,并有效遏制了市场中蜂蜜C4植物糖浆掺假。C、S、H三种稳定同位素对于蜂蜜的产地鉴别效果良好,尤其是鉴别来源于环境差异较大的不同产地同种蜂蜜方面,具有较高的鉴别率。IRMS技术与其他技术联用可有效提升不同植物来源蜂蜜的鉴别效果。同时,IRMS技术也存在某些不足,例如无法有效鉴别蜂蜜中掺C3植物糖浆,自然环境差异较小的产地鉴别率偏低。其次,目前应用于蜂蜜研究中的稳定同位素主要涉及C、N、H、O、S等元素,而其他稳定同位素如Pb、Si在蜂蜜中的研究较少。随着稳定同位素技术和其他技术的发展,两种或多种技术的联用将更好的溯源蜂蜜的真实性,具有更好的应用前景。