肿瘤患者来源的异种移植(PDX)模型

师长宏

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

1 背景

将患者新鲜的肿瘤组织移植于免疫缺陷小鼠建立的患者来源的异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型较好地保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性, 在肿瘤的个体化治疗研究中具有独特的优势[1]。其优点在于: 移植所用标本直接来源于人体肿瘤组织, 较好地保留了肿瘤间质和干细胞成分, 使肿瘤生长的微环境更接近原发瘤; 不同PDX模型反映不同患者来源的样本之间的差异，更接近于患者的实际情况，适用于抗肿瘤药物和生物标志物的研究; 也可为肿瘤样本的保存和传代提供大量标本。传统的细胞系移植模型(cell-derived xenograft, CDX)，经过长期的体外培养，肿瘤细胞为了适应外环境，丧失了异质性，获得的实验结果趋于同质化。而PDX模型未经过体外培养，稳定地保留了原发瘤的遗传特性、组织学和表型特征，实验结果临床预见性更好。

2 PDX模型的基本特征

将人体肿瘤标本接种至小鼠体内，生长出的肿瘤组织连续接种到新的小鼠体内，传至第三代肿瘤能够稳定生长且80%以上成瘤，表示PDX模型建立成功。体内成瘤时间不超过12周; 将模型肿瘤组织冻存在液氮内，复苏后移植于小鼠体内可以稳定生长。为了保持原发肿瘤的组织形态，体内传代次数应不超过10代[2]。

常用PDX模型的移植方法包括: ①皮下移植，肿瘤一般局限于皮下成团生长，很少出现转移和扩散，移植成功率较低，只有约25%。②肾包膜由于血供丰富，组织相容性好是较常采用的移植方法, 其成功率能达到70%以上，在膀胱癌、结肠癌、肺癌的移植中成功率可达到95%以上。③原位移植是将肿瘤组织移植到小鼠体内与其同源的组织内，其影响因素较多，成功率低，建模难度大，特别是一些消化道肿瘤，因其原位处于消化道腔内，其移植的成功率进一步降低[3]。

确认PDX模型与原发瘤的组织相似性至关重要，其溯源方法包括: ①组织形态学比较，通过组织学类型和Lauren分类等方法对移植瘤和原发瘤组织形态进行分析，判断一致性。同时关注PDX模型是否保留了原发瘤的微环境特征[4]。②肿瘤特异性标志物分析，人源性的特异性标志物检测能够确定移植瘤的来源，进而对比二者的一致性。特异性标志物的表达与某一类型肿瘤的发生密切相关，也是指导临床诊断和治疗策略的潜在分子靶点，如甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA), 前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)和糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等。③短片段重复序列分型(short tandem repeat，STR)，STR序列广泛存在于哺乳动物的基因组中，多态性程度高，通常由2～6个碱基构成一个核心序列，重复数目的变化决定多态性。对于特定个体，染色体上某一位置的重复序列和重复次数是固定的。通过检测就可以明确区分个体的不同，确定亲缘关系。④测序分析，通过多个基因外显子和RNA测序，可以确定原发瘤的遗传特征是否在PDX模型异体生长和传代期间发生变化；也可通过测序分析PDX模型的碱基突变特征、等位基因频率和RNA表达水平方面是否与对应原发瘤具有相关性。

3 国内外研究现状

PDX模型保持了原发性瘤中大多数的关键基因和信号通路活性，更能模拟肿瘤患者亲本基因学特征，这些应用于靶向药物筛选试验具有独特优势。可以根据每个肿瘤患者PDX模型的特征，筛选敏感的治疗药物，制定个体化的治疗方案，在临床前研究中用于评估肿瘤的个体化疗效。Keysar 等[5]利用建立的PDX模型，研究分析了 PI3K 通路在鳞状细胞癌中的表达情况，并通过药物实验证实了PI3K 抑制剂可以作为一个候选药物的靶点，而在CDX模型中PI3K 抑制剂的作用并不明显。PDX模型充分展示了肿瘤的临床特点和患者个体的遗传特异性，细胞遗传学分析显示PDX肿瘤最大限度的保留了原发患者的染色体结构，并且在组织形态、转录组、多态性和拷贝数变异方面也具有较好的一致性[6]。比如，具有PI3KCA基因突变和KRAS/BRAF野生型的结肠癌PDX模型已成功建立，但这种亚型在结肠癌细胞系中并未发现[7]。

PDX模型所具有的细胞学和分子学的异质性,使得一些发生遗传变异的肿瘤细胞亚群在长期的治疗过程中被筛选和富集下来, 从而被用于发现新的生物标记预测药物的敏感性或耐药性。如西妥昔单克隆抗体结合靶点为表皮生长因子受体(EGFR), 使用79个PDX模型(包括肠癌、胃癌、头颈肿瘤、肺癌和乳腺癌)用于评价西妥昔单克隆抗体的活性, 结果表明RAS通路突变、EGFR的表达、EGFR的磷酸化、Erb3的表达、Akt的活化以及MET的磷酸化等10个生物标志, 可用于预测西妥昔单克隆抗体的敏感性或抗性作用[8]。

不同肿瘤患者来源的PDX模型其性质可能会略有不同，甚至体现在基因的表达上，但可能拥有相同的药物靶点，因此，开展基于PDX模型基因组学的肿瘤靶向药物筛选，对于PDX模型的应用具有重要意义。首先对建立的PDX模型进行基因测序和分型，分析肿瘤遗传改变情况，在基因水平上进行分组研究。然后针对不同的基因型分组，采取相应的靶向药物进行试验, 而不考虑肿瘤类型。记录各组药物的疗效差异, 研究不同药物在不同基因型模型上的反应过程，分析来源和基因型特征，目的是从个性研究中，整合出共性结论[9]。

利用PDX模型也可对肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用进行研究。在PDX模型早期传代过程中，包括间充质细胞和浸润性淋巴细胞在内的人间质细胞参与了肿瘤的形成。已证实血液肿瘤和实体瘤都含有原始肿瘤细胞(tumor-initiating cells, TICs)或肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)亚群[10,11]。虽然上述细胞只是肿瘤组织中极少部分细胞亚群，但实验表明TICs更能抵抗辐射、化疗和靶向治疗，这对于耐药和肿瘤的复发研究非常重要[12]。PDX模型体现了TIC的主要生物学特性，可以使用特定标记物从人体肿瘤活组织持续分离出大量的TICs。已证实在PDX模型中具有TIC特征的CD133+(高致瘤基因)亚群在非小细胞肺癌中能引起顺铂的抗性[13]。

总之，患者来源肿瘤异种移植(PDTX)模型保持和稳定了原发肿瘤的遗传、组织和表型特征; 保存了肿瘤组织中间质和干细胞成份; 有利于肿瘤组织中生物标志物的评估，可用于测试抗肿瘤药物的敏感性和预测患者的预后，实现肿瘤的个性化治疗。

4 PDX模型研究中存在的问题

4.1 移植成功率

提高PDX模型成功率需要重点关注以下因素:①肿瘤自身因素，与其它肿瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX模型建模更难。恶性程度高、分化程度低的肿瘤移植成功率较高; 移植肿瘤细胞的数量越多成功率越高[14]。②宿主因素，敲除一些免疫相关基因可获得重度联合免疫缺陷小鼠，适合人源细胞移植，特别是NOD-PrkdcscidIl2rgnull小鼠，是迄今免疫缺陷程度最高的小鼠，保证了高的移植成功率[15]。③技术因素，标本的新鲜度及标本离体后到移植间的时间是影响细胞活性的一个重要因素，需要外科医生、组织学家和研究者密切配合; 饲养环境以及标本的污染程度也会影响移植成功率。因此，每个样本需要移植大量的受体鼠，需观察3个月以上才能决定模型是否成功。

4.2 人源化问题

人和鼠始终是两种不同的物种，无法完全消除物种间的差异。移植过程中小鼠基质会逐渐替代原发瘤基质。肿瘤组织在小鼠体内传代过程中，也可能导致个别基因的改变而无法准确反映患者的病情; 由于PDX模型使用免疫缺陷动物，导致无法筛选免疫调节药物或通过免疫功能激活的药物[16]。

4.3 淋巴瘤的发生

在不同类型肿瘤的PDX模型中，均有个别病例形成与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)相关的B细胞淋巴瘤，在胃癌的PDX模型中发生比例最高，且制备模型使用的均为NOD/SCID或NOD小鼠。分析原因可能是EBV感染的B细胞在人体内处于潜伏状态，但当移植到重度免疫缺陷小鼠后，由于缺乏功能性免疫细胞，易被活化形成淋巴瘤。由于幽门螺杆菌相关的胃炎与胃癌的发生高度相关，在胃癌病例中基底炎症发生程度显著高于其它肿瘤，从而胃癌PDX模型中淋巴瘤的发生率显著高于其它肿瘤[17]。

4.4 药物评价中治疗策略的选择

由于PDX模型代表了不同患者的状况，在筛药过程中化疗药物剂量、治疗频次需要个体化的策略，通过预实验进行调整; 同时PDX模型治疗前的分组、治疗时机、治疗周期，停药后观察时间等因素都会影响药物的评价效果[18]。

4.5 正确评估和应用PDX模型

目前PDX模型广泛应用于新药评价和肿瘤新靶标的筛选，体现出良好的应用前景。在国内，一些大学和科研院所积极与医药研发企业合作，投入大量资金和人力从事PDX模型的应用研究。2017年度国家生物医学重点专项中设立精准医学研究课题，涉及个性化药物评价体系建立，包括建立中国人群遗传背景的PDX模型不少于2 000例。

尽管如此, 2016年Nature和N Engl J Med均发文对包括PDX模型在内的精准医学提出质疑[19,20]。通过大量的临床实验研究和数据分析，结合测序等分子诊断技术，表明只有约30%～50%的患者能找到可以解释肿瘤恶变的相关突变，而相应的药物有限，只有3%～13%的患者能够找到精准的药物，其中只有30%的患者有疗效。最后真正受益的患者仅占所有患者的1.5%。分析个体化治疗药物不够理想的原因主要是: ①适用个体有限; ②制模周期较长，成本过高; ③肿瘤异质性，即同一个患者的肿瘤细胞有多个突变株，治好了一部分细胞，另一部分又长出来了; ④一开始有效的药物，可能很快就产生了耐药性。因此，从目前临床数据看，基于PDX模型的个体化治疗还没有显示出实质性疗效，仍处于临床验证阶段。

5 展望

PDX模型的建立和应用为肿瘤学研究，特别是药物的个体化应用提供了良好的实验平台。但需要注意的是在强调肿瘤PDX模型个体化的同时，需要运用共性研究思维，针对PDX模型的基因组特征开展靶向治疗，提高模型的应用效能，获得更多的肿瘤亚型和更为高效的靶向选择方案。同时，应鼓励不同部门和机构加强协作，建立肿瘤异种移植模型的数据库，共享PDX模型的信息与研究结果，从而使更多的患者受益。

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