动物源性食品安全检测技术研究进展

崔震昆,周 威,胡梁斌,莫海珍,董建国,2,李红波,*

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003; 2.林州市第二高级中学,河南安阳 456550)

近几年，食品安全问题受到了全球的关注,成为一个民生话题。食品安全决定消费者对食品企业的信任度,甚至关乎一个国家的经济命脉,所以食品安全检测关键技术的研究至关重要。目前食品检测技术从广度和深度上都有了长足的进步,检测范围涉及到食品中是否含有有毒物质、食品的营养物质、化学成分以及食品中所含的微生物及菌的种类、性质和数量。与过去相比,现如今的食品检测重心更侧重于食品的安全与营养。

继2013年瑞典、英国等多个国家卷入“马肉风波”,2014年沃尔玛中国区“挂驴头卖狐肉”之后,2017年6月受杀虫剂氟虫腈污染的“毒鸡蛋”风波再次引发了一场欧洲食品安全危机;而我国,火锅文明的成都因地沟油事件陷入舆论漩涡,三聚氰胺事件使国内乳品行业面临信用危机。近几年来,世界各地相似事件时有发生,经济利益驱动下的掺假使得越来越多的消费者在购买动物源性食品时,更加关注食品的质量和材料的真实性。生鲜肉根据其色泽、气味、触摸等手段尚能辨别,但经过加工重组的动物源性食品,其物种的原有形态已被破坏,感官鉴定很难辨别真伪。十九大以来,我国多地全力推进食品安全示范区创建工作,密切关注食品安全动态,集中力量加强监管,加大市场巡查力度,多种检测技术应运而生,但目前尚未形成一套简易高效的理想检测程序,动物源性食品检测技术尚待规范优化。

本文概述了动物性食品定义与分类及其掺假类型、检测方法等方面的研究进展,以期为动物源性食品的安全检测提供新的思路。

1 动物源性食品定义、分类

动物源性食品(Animal derived food)指全部可食用的动物组织以及蛋和奶,包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等。动物源性食品的分类根据各国标准不同因地而异,通常所说的动物源性食品是指人类食用的肉蛋奶及其制品,广义地讲,非人类食用的掺肉蛋奶饲料也应划分到动物源性食品之列。

2 动物源性食品掺假类型

Ballin[1]将肉制品掺假归为四类:来源欺诈、成分替代、加工过程改变及非肉类成分添加。来源欺诈是指肉品标注的性别、年龄、养殖方式、地理溯源及饲料摄取等与事实不符。成分替代是指将廉价肉品替换或掺入高价肉品,这些低价肉品可能是低价可食用肉类,如猪肉、鸡肉、鸭肉掺入牛羊肉;也可能是非食用肉类,如狐狸肉、貂肉、甚至流浪猫狗肉、老鼠肉等,这种掺假方式最为恶劣,消费者可能因为食用这些未经检验检疫的肉品而产生严重的健康隐患。加工过程改变主要涉及肉品新鲜与否、是否化冻等方面的欺诈。非肉类成分添加可能涉及着色剂、防腐剂、香味剂的添加,以及注水、加入大豆粉等方式。

根据给消费者带来的伤害程度不同,掺假类型又可分为3类:a.高价肉中掺入人类可食用的低价肉或非肉类成分,如牛羊肉中掺入鸡肉、猪肉、淀粉、香精等,给消费者带来直接的经济损失;b.可食用肉类中掺入不以食用为目的的肉类,如猪牛羊肉中掺入狐狸肉、貂肉等,这些肉类主要由生产毛皮为主的养殖场提供,经济利益的驱动下动物被无节制地用药催长,体内激素含量绝大多数超标,给消费者的身体健康带来安全隐患;c.可食用肉类中掺入不可食用肉类,如直接将未经检疫的猫、狗、鼠等流浪动物杀害后掺加到猪牛羊等碎肉中,消费者食用后极容易感染疾病,甚至危及生命。

3 动物源性食品检测方法

3.1 感官鉴定法

Sidel等[2]认为:感官评价是用于唤起、测量、分析和解释产品,通过视觉、嗅觉、触觉、味觉和听觉所引起反应的一种科学方法。肉类产品感官鉴定方法分为:a.视觉鉴定法:用眼睛观察产品的颜色、形态、结构,如产品颜色是否均匀有光泽、有无纹理变化,是否淤血、出水、肿大、霉变等;b.嗅觉鉴定法:用鼻子闻肉产品气味来鉴定,如生猪肉应该是血腥味,次鲜肉血腥味降低,兼有氨味、酸味甚至霉味,更高一步要求,应将肉加热,待肉中脂肪发生美拉德等化学反应后，根据肉发出的香气鉴定;c.触觉鉴定法:用手触碰产品,根据产品的弹性、硬度、黏度、温度,或直接品尝感受产品的咀嚼性、含水量、汁液量;d.味觉鉴定法:通过舌头感受产品的酸、甜、苦、辣、咸、鲜、香,并感受味道的细微变化。感官鉴定是靠主观感觉判断的,从测定到形成概念之间的许多因素,如嗜好与偏爱、经验、广告、价格等都会影响检验结果,再者肉产品如经破碎、重组等加工过程后,感官判断的准确性会大大降低。目前,感官鉴定主要用于小型、少量的家用生鲜肉产品的购置中及实验室部分研究中。

3.2 显微镜检测法

显微镜检测法是欧盟认可的饲料检测方法,主要用于检测动物饲料中的骨粉、肉粉、骨肉粉、血粉、鱼粉、羽毛粉等。欧盟曾组织了28个实验室对该方法进行评估,结论提出:a.操作者要具备丰富的实践经验;b.样品中有骨头碎片才能定量,碎片检测的极限含量为0.1%或更低;c.该方法不能单独用于区别动物种类。该法因样品量少,简单易行已被官方分析家协会(AOAC)写入法典,并被意大利定为官方检测方法,我国在1993年将该法定位为饲料检测国标(GB/T 14698-1993)。该方法存在的弊端为:显微镜成本较高、检测耗时、检测人员要求专业性强、且无法确定动物种类和品种。该法主要用于饲料检测,在人类食用的动物源性食品中应用较少。

3.3 蛋白质检测法

3.3.1 电泳学(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,简称SDS-PAGE) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。肉类SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是通过对动物肌肉组织进行不同温度热处理,对处理后的样品提取可溶性蛋白质进行电泳,根据电泳图谱判断肉制品中动物源性成分。Day等[3]利用毛细管凝胶电泳鉴别了机械加工和手动去骨的鸡肉产品的血红蛋白的区别,指出机械加工过程中血红蛋白受损,手动去骨的鸡肉产品血红蛋白含量明显高于机械加工的产品;Vallejo等[4]用十二烷基硫酸钠聚合物填充毛细管凝胶电泳,描述、比较、量化了牛和鸵鸟肌肉中水溶性蛋白(WSP)和盐溶蛋白(SSP),并建立了牛血清白蛋白标准曲线生成了单个蛋白质的定量数据,同时论证了鸵鸟及牛肉两种不同物种之间的个体差异性。该法在我国近几年的研究中也不仅仅局限在动物种类的区分上,阿力木·吾布力等[5]利用该法对新疆特种牛乳成分进行分析鉴别,指出SDS-PAGE鉴别掺伪的最低比例为1∶10(V牛乳/V特种乳);侯艳霞等[6]采用该法分析论证了4种鲜奶蛋白质组分的差异;张婷等[7]用该法研究了4种鱼的血清、体表黏液蛋白质差异性;同时SDS-PAGE在植物源性成分的鉴定中也被广泛应用[8-9]。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有特异性强、灵敏度高、结果直观可靠的优点,但电荷异常或结构异常(如带有较大辅基,或蛋白质结构被严重破坏后重组)的蛋白质不能采用该法,且该法有10%的误差，不可完全信任。

3.3.2 酶联免疫吸附测定法(简称酶联免疫法,ELISA法) 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,即酶联免疫吸附测定法。它的中心原理就是让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测。该法可利用肉类在热处理过程中稳定的肌钙蛋白I(TnI)为标记区分动物种类,在肉类来源鉴别中具有很好的效果[10]。Giovannacci等[11]指出，酶联免疫吸附测定法还可用于深加工重组肉中动物源性成分(如猪肉、牛肉、绵羊和家禽含量)的鉴定,而且每种肉的检测都有各自不同的极限阈值。但在Hsieh等[12]的研究中，采用ELISA、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、平板凝胶电泳(SGE)和毛细管凝胶电泳(CGE)等几种方法对来自牛、鸡、猪、羊4种动物的24种动物源性罐头进行对比分析,研究发现平板凝胶电泳(SGE)和ELISA的准确率仅为22/24(92%)和14/24(58%),而PCR-RFLP较两种检测方法具有更高的灵敏度和准确性。可见ELISA法也有自身的不足之处,因为该法在应用过程中需要分离品种特异性的蛋白质,品种接近的蛋白质之间能够发生交叉反应,甚至其他品种的蛋白质能够掩盖品种特异性的条带,因此会产生假阳性结果,而且该法样品处理过程复杂,目前用于动物源性检测的试剂盒灵敏度较低,不适用于广泛推广。

目前酶联免疫法用于动物源性食品中某种特定物质残留的检测较多。如Li等[13]研究并论述了蛋黄中庆大霉素和卡那霉素的残留;Chen等[14]研究了马波沙星和氧氟沙星在猪肉和牛奶中的残留情况;杨典原[15]以新西兰大白兔作为免疫动物,经过5次免疫获得高效价血清,并通过proteinA-sepharuse亲和层析法纯化血清,经SDS-PAGE验证后,分别建立了完整的IC-ELISA法(线性方程为y=-0.19943+1.2313,IC50值为4.5 μg/mL,检测限为0.53 ng/mL)和BA-ELISA法(线性方程为y=-0.32216+1.5559,IC50值为1.9 μg/mg,检测限为0.15 ng/mg),实验结果指出，以上两种方法均对氟苯尼考(FFC)的结构类似物氯霉素有交叉反应,而对其他的FFC功能类似物无交叉,且两种方法都具有特异性强、灵敏度高的优势,但二者相比,BA-ELISA检测限更低;赵秋伶等[16]建立了用于测定动物源性食品中的卡那霉素残留的酶联适体分析法,并考察了包被浓度、竞争反应时间、核酸外切酶Ⅰ用量及封闭液等因素对检测的影响,在优化的实验条件下得到以下结论:卡那霉素检测限为3.26 μg/L,线性范围5～100 μg/L,在不同肉类中添加5.0、20.0、50.0 μg/kg的卡那霉素时,加标回收率可达75.8%～90.6%,相对标准偏差RSD为4.2%～7.8%,且该方法无需大型仪器,操作简单,可用于动物源性食品中卡那霉素残留的快速检测。

3.3.3 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法在动物源性食品中的应用主要是蛋白质分析法。利用高温高压使氨基酸共价键断裂,蛋白质降解成多肽,从而检测食品中有无组织特异性的二肽或多肽,目前该法可作为一种代替显微镜技术的便捷方法用于动物源性食品中残留物的鉴定。Claeys等[17]利用反相高效液相色谱结合无水乙醇代替皂化法，测定了新鲜猪肉、熟火腿、皮下脂肪、肝脏、蛋黄、牛奶和复合猪饲料中α-生育酚的含量,研究指出用无水乙醇(回收率82%～103%)代替皂化法(回收率66%～90%)经反相高效液相色谱下测定的α-生育酚提取率和回收率均高;Zhu等[18]建立了同时测定猪肉、牛肉、鲤鱼、鲫鱼4种动物源性食品中15种生物胺含量的高效液相色谱法,所建立的方法检测限(LOD)范围为0.002～0.03 mg,回收率达70.49%～121.16%,日内和日间精密度(RSD)分别为0.30%～4.60%和4.62%～14.97%,数据充分表明，该法能够准确、定量测定动物源性产品中15种可能对人体健康具有重要生理意义的生物胺。池永红等[19]结合固相萃取串联高效液相色谱,以鸡肉、鸡蛋、牛奶和牛肉等复杂食品为原料,建立了动物源性食品中氟喹诺酮类抗菌药物(诺氟沙星、环丙沙星,恩诺沙星)残留的分析方法,并指出三种物质的最低检出限分别为1.5、1.3、1.5 μg/L,试验结果具有较高的准确度(回收率90.0%)和重现性(RSD为5.0%,n=3);杨朝琳[20]经过多年研究建立了HPLC-MS/MS快速测定鸡蛋中8种氟喹诺酮类药物和牛奶中沙拉沙星、依诺沙星等14种氟喹诺酮类药物残留的方法,指出HPLC-MS/MS检测方法灵敏度高、选择性好,且能高效、快速地同时检测多种抗生素;郝杰等[21]通过固相萃取法结合超高效液相色谱-串联质谱法，建立了同时检测猪肉、鱼、虾等动物源性食品中磺胺类、喹诺酮类、糖皮质激素类、大环内酯类、β-受体激动剂类、类固醇激素类、四环素类、青霉素类、氯霉素类、头孢菌素类10大类72种兽药残留的分析方法,极大地提高了多残留兽药的检测效率,为食品安全突发事件应急处置中多残留兽药的快速分析提供了理论依据。

3.4 红外光谱分析法

Karl Norris作为近红外光谱分析技术发展的奠基人,率先于20世纪50年代在美国农业部的支持下进行农产品(包括谷物、饲料、水果、蔬菜等)成分快速定量检测的研究。该方法的优点有:a.简单方便,有不同的测样器件可直接测定液体、固体、半固体和胶状体等样品,检测成本低;b.分析速度快,一般样品可在1 min内完成;c.适用于近红外分析的光导纤维易得到,易实现在线分析及监测,极适合于生产过程和恶劣环境下的样品分析;d.不损伤样品可称为无损检测;e.分辨率高，可同时对样品多个组分进行定性和定量分析等。

目前近红外技术在食品领域应用较广泛。Fei等[22]研究并探讨了红外光谱法鉴别动物饲料的能力,试验分别将非反刍动物和反刍动物的原料肉或骨粉按照一定比例混合,红外光谱结合化学计量学分析法建立了量化反刍动物掺假的PLS模型，并证明了模型的有效性(R2>0.90),结果表明,根据脂质特性可以成功地鉴别反刍动物掺假情况;Gao等[23]以猪、家禽、牛、绵羊、鱼骨粉为原料,利用红外光谱法对82个动物源性样品进行检测,敏感性和特异性接近1,分类误差几乎为0;吕程序等[24]利用12个动物源性成分饲料样品和14个植物源性成分饲料样品建立偏最小二乘定标模型,经平均光谱优化后,得出模型的决定系数、交互验证标准差分别为0.969、0.090,该结论表明显微近红外光谱分析技术用于动物源性成分的检测简易高效、准确性高。红外光谱分析法的缺点是该手段属于间接检测方法,需要大量权威性的标准样品作为校对和参考模型,即针对不同动物成分、不同组分所建立光谱库。

3.5 以核酸为基础的检测方法

3.5.1 DNA杂交技术 DNA杂交的原理其实就是碱基互补配对,最初用于动物源性成分的DNA研究是建立在标记DNA探针与样品杂交的基础上,曾用于证明了牛、山羊、绵羊等相近物种之间的同源性[25],由于该方法操作复杂,且不能用于复杂样品的掺假检测上,在实际研究中应用较少。

3.5.2 基因芯片技术 基因芯片技术又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法，将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。近几年,国外关于基因芯片技术应用于动物源性食品的研究中报道较少。我国学者朱业培等[26]以线粒体基因和细胞色素基因为目标基因,建立了同时检测6种动物源性成分的基因芯片方法,效果评价显示该方法对6种动物源性成分的检测快速高效且特异性好,可推广至生、熟肉制品中多种动物源性成分的检测和鉴别,研究还指出该法检测牛肉和马肉的绝对灵敏度为0.5 pg,实际检测灵敏度达0.001%。石丰运等[27]选择线粒体DNA(mtDNA)16S rRNA基因为目标基因,建立了牛、山羊、猪、鸡4种动物的基因芯片检测方法,为进出口饲料中的动物源性成分的鉴别提供了新的检测方法和技术支持;王振全[28]经过多次实验最终成功实现了利用基因芯片技术一次反应就可对H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、2型猪链球菌、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157 6种病原的同步检测,对人兽共患病的预防、控制提供了理论参考。

3.5.3 DNA条形码技术 DNA条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。在国外DNA条形码技术较早用于鉴定物种及物种间亲缘关系。如Vences等[29]利用DNA条形码技术尝试破译两栖类动物青蛙和火蜥蜴的基因差异,发现COX1序列能够正确地识别物种;随后Holmes等[30]提出该技术可应用于海上渔业的快速检测手段,并从澳大利亚水域成功检测出了非法打捞的世界级珍奇鱼种;Hellberg等[31]从83种鱼产品中提取DNA条形码,并与PCR技术作对比,最后在改良的基础上成功制作出了低成本、用时短的DNA试剂盒检测装置。近几年,我国在DNA条形码技术方面也有所突破。如Shuang等[32]用细胞色素C氧化酶I(COI)基因作为靶基因,建立了直接识别牛肉、羊肉、猪肉、鸭四种动物的条形码检测方法,并成功检测出了牛肉样品中鸭肉掺假的事实;Wang等[33]用DNA条形码技术对上海63种鱼进行分类鉴定,结果发现13种鱼产品名称与事实不符,19种鱼产品名称仅标注为类别或俗名,并呼吁我国鱼类及鱼源性产品的种类、名称混乱无序,分类不清,鱼种权威性鉴定需要规范和加强。

3.5.4 环介导等温扩增技术(LAMP) 环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,它以目的基因的特异区设计引物,利用Bst DNA酶在恒温下孵育完成目的基因的扩增,具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术,它不依赖任何专门的仪器设备就能实现现场高通量快速检测,且成本远低于荧光定量PCR,在国内外研究中备受关注。Song等[34]建立了鸡、鸭、牛、羊4种动物的LAMP可视化快速检测方法,检出限达0.01%;杨丽霞等[35]建立了生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法,并指出该法操作简单、直观性强,更适合基层监管部门进行肉制品现场快速检测;李向丽等[36]对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分鉴定,建立了肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增检测方法;唐小春等[37]发明了一种基于LAMP方法快速检测肉类掺假的试剂盒,不需要使用凝胶电泳,避免了使用溴化乙锭等有毒药品,在1 h内只需肉眼进行观测(阳性结果为绿色,阴性结果为橙色),可以一次性检测多种肉源性食品(猪肉,最低限度10624 ng;狐狸肉,最低限度10624 ng;老鼠肉,最低限度10625 ng;鸡肉,最低限度10623 ng;鸭肉,最低限度10625 ng),大大提高了检测效率;目前,该方法用于病菌的检测在我国也取得了一定成效[38-41]。

3.5.5 聚合酶链式反应(PCR)技术 PCR是一种选择性体外扩增DNA片段的方法,其最大特点是能将微量DNA大幅增加。PCR技术由美国Mullis于1983年首先提出,1985年聚合酶链反应,即简易DNA扩增法真正诞生,至2013年PCR已发展到第三代技术。由单一PCR技术发展起来的相关检测方法主要包括:多重PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、适时荧光PCR(RT-PCR)(扩增内标)、巢式PCR等。目前,PCR技术由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效,且对标本纯度要求低、无污染、易推广等的特点在国内外肉类掺假的研究中被广泛应用,并被多个组织和国家定为食品、饲料的法定检测手段。

PCR技术在物种源性成分鉴定方面的应用研究发展迅速。Shinoda等[43]利用PCR技术与电脑编程结合制定出一种特定的动物源性食品检测程序,该法得到牛肉骨粉检出限为0.05%～0.01%,牛DNA检出限为0.1 g,还成功地将引物应用于17种已知反刍动物来源的商业饲料样品,均未发现假阳性结果;Zeng等[44]建立多重实时荧光PCR法检测牛、羊源性材料,该法检测时间减少了三分之一,灵敏度比常规国标PCR高10倍,并适用于牛、山羊、绵羊原料肉、奶、毛皮、油脂及饲料的检测;Ali等[45]研究制定了清真食品中猫、狗、猪、猴、老鼠五种肉的多重PCR检测法,在原料肉中DNA检出限为0.0100～0.0202 ng,重组丸子肉种检出限为1%;Hou等[46]建立了一种同时检测牛肉、猪肉、羊肉和鹌鹑肉制品中鸡肉、鸭和鹅DNA的多重PCR方法,研究指出目标DNA检出限为0.05 ng,目标肉检出含量占总肉重的1%;Tao等[47]从南京不同的超市和农贸市场采集食品样品200余种,建立了基于新的靶基因的多重PCR检测技术,该技术可以在12 h内高精度、高灵敏度地检测出多种流行性李斯特菌,为今后动物源性食品中李斯特菌的检测提供了重要参考;Xu等[48]建立了同时检测鸡、鸭、猪、牛4种肉的多重荧光定量核酸实时聚合酶链反应法,并通过绵羊、马、鹿、驴、兔、鹅、山羊、虾、鲑鱼、玉米线粒体DNA作为目标基因确定不相关，验证了这一检测的特异性。结果指出该法达到每种0.01%水平的检测限,且结果与国家标准检测结果一致,准确度为98%;Chen等[49]利用多重实时PCR(RT-PCR)技术检测绵羊、牛和植物源性成分,建立了稳定的双、三重RT-PCR系统,并进行了特异性试验，保证检测准确性的同时得出结论:绵羊、牛和植物源性成分DNA检出最低限为0.1 ng,山羊奶中牛奶的检出限为0.1%(体积分数),山羊奶中豆浆的检出限为0.5%(体积分数)。但是由于PCR检测样品前处理方法尚未相应的国家标准,且在行业标准中也未见明确规定,在实际操作过程中如何前处理存在意见不统一现象,导致检测结果不尽相同,权威性标准样品待规范统一,导致PCR技术在动物源性食品检测应用有一定的局限性。

4 结论与展望

2017年6月在北京召开了“第六届中国动物源性食品安全高峰论坛”,同年12月国家食药监局重新修订了《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》;2018年1月在张家口建立了生物安全PCR实验室,将“猪源性成分测定”应用于食品检测领域。由此可见,动物源性食品的安全在我国已提上日程且备受关注。食品安全检测技术在国内的研究不断突破与创新,已趋近于世界先进水平:感官鉴定主观性强;蛋白质检测精确度有待提高;DNA杂交、条形码技术和基因芯片技术操作难度大、成本较高;红外光谱技术缺乏权威性和标准数据库;环介导等温扩增技术体现优势地位,有待突破;PCR技术日益成熟并逐渐占据主体地位。因此,寻找适合应用动物源性食品安全检测方法,发挥各种检测技术的优势互补将成为重要的技术方向。