真菌诱导子在长春花培养体系中的应用

梁楚欣，于荣敏，朱建华

（暨南大学药学院，广东 广州 510632）

长春花[Catharanthus roseus(L.) Don]为夹竹桃科长春花属多年生药用植物。迄今已从长春花中分离得到生物碱达130余种，大多数为萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloid，TIA）[1]。部分TIA具有明显的生物活性并广泛地应用于各种疾病的治疗，如长春碱（vinblastine）和长春新碱（vincristine）广泛应用于何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞性白血病等疾病的治疗[2]。该类抗肿瘤药物主要从长春花叶中提取分离获得[3]。然而，这些化合物在植物中含量极微，且化学合成和半合成成本太高，如何提高长春花中TIA产量成为国内外学者研究的重点[4]。

在植物科学中，诱导子（elicitor）是指在植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应（hypersensitive reaction，HR）或自身防御反应（self-defense reaction）的因子[5]。诱导子可来源于植物、真菌、细菌等多种生物，根据其来源可分为生物诱导子（biotic elicitor）和非生物诱导子（abiotic elicitor），生物诱导子主要包括植物细胞成分及病原菌即细菌、真菌与病毒，而非生物诱导子则包括能起诱导作用的金属离子和无机物[6-8]。

近年，越来越多的研究表明真菌诱导子（fungal elicitor）在调控生物次生代谢途径及细胞内信息传导等方面有重要作用。在提高药用植物次生代谢产物产量的研究中，用真菌诱导子处理植物细胞培养体系已成为快速提高植物细胞培养物中目标产物产量的有效方法之一[7,9]。本文主要涉及真菌诱导子的简介，以及真菌诱导子在长春花培养体系中的研究进展

1 真菌诱导子的发现与概述

1968年，Cruickshank等[10]从丛梗孢科链核盘属链合盘菌Monilinia fructicola的菌丝体中分离得到一种多肽——链核盘素A（monilicolin A），并将其加入菜豆细胞培养基，发现monilicolin A能诱导菜豆果皮的形成和菜豆素（phaseollin）的积累。Monilicolin A作为首个被报道的真菌诱导子，使得真菌作为一种新型诱导子在植物与真菌相互作用的病理学机制及提高药用植物次生代谢物产量等研究领域中受到了广泛关注。

真菌诱导子是来源于真菌的一类活性物质，能快速、专一地诱导植物特定基因的表达，从而活化特定次生代谢途径，使目的次生代谢产物的积累量增加[9]。值得注意的是，用于制备诱导子的真菌，既可以是植物致病性的或内源性的，也可以是与植物完全无关的真菌。真菌诱导子的组分主要包括真菌的菌丝体、菌丝体降解产物、真菌分泌物等，而化学成分一般为多糖、寡糖、多肽和蛋白质等[11]。上述化学成分与信号分子的传导过程密切相关。现有研究结果表明，真菌诱导子首先与细胞膜表面受体结合并被植物细胞识别，然后通过各种信号传导途径使植物基因的表达发生变化，从而使植物次生代谢产物生物合成途径中相关酶的活性受到调节，最终引起植物细胞产生防御反应并促进特定次生代谢产物的生成和积累[12]。

目前，该类诱导子主要应用于植物和微生物细胞产生次生代谢产物两个方面，在提高药用植物培养物中天然产物的产率方面取得较为明显的进展。在药用植物培养中，人们利用不同的真菌诱导子实现了萜类、生物碱类、皂苷类、黄酮类及多酚类等多种化合物的诱导合成及产量提高[4,7,12-14]。真菌诱导子虽能很好地调控次生代谢物的产量，但其诱导效果因真菌种类、诱导子组分、剂量、加入时间及植物细胞培养物的种类等因素的不同而有所差异[15-17]。

2 真菌诱导子在长春花培养体系中的应用现状

2.1 利用真菌诱导子提高次生代谢物的产量

长春花中多数吲哚类生物碱具有重要的生物活性，但这些有效成分的含量较低，且化学合成和半合成成本昂贵。因此，人们开始致力于提高长春花中生物碱的含量。而真菌诱导子以其独有的优势，成为提高长春花中TIA含量的其中一种重要手段[18-19]。

Zhao等[20-21]利用真菌诱导子与化学试剂联合处理长春花悬浮细胞的方法，先后提高了细胞中阿吗碱（ajmalicine）和长春质碱（catharanthine）的产量。随后，Namdeo等[22]证实黑曲霉（Aspergillus niger）、串珠镰孢（Fusarium moniliforme）和绿色木霉（Trichoderma viride）真菌诱导子能有效地提高长春花悬浮细胞中阿吗碱的产量，且阿吗碱的产量与诱导子的剂量呈一定相关性。石岳香等[23]将镰刀菌属内生真菌F9作用于长春花悬浮细胞培养体系后，发现该真菌及其诱导子能影响长春花悬浮细胞的生长率，导致细胞代谢结构发生改变，并使生物碱的产量得以提高。

然而，真菌诱导子对长春花生物碱合成的诱导效果不仅与真菌的种类、诱导子的剂量有关，还与诱导时间长短以及植物细胞培养物的种类等多种因素相关。这促使国内外学者加深了在这些方面的研究。用来自12种不同真菌的诱导子对长春花悬浮细胞进行诱导实验后，Zhao等[16]发现10 mg/L稻曲霉（Ustilaginodia verens）诱导子和20 mg/L黑曲霉（Aspergillum niger）诱导子的诱导效果最好；诱导子的处理时间以2～4 d为宜，时间太短则效果不明显，时间过长则会抑制生物碱合成并造成细胞死亡。张向飞等[24]则用分别来源于镰刀菌（Fusarium solani）和Aspergillum niger的真菌诱导子，对长春花愈伤组织进行诱导处理。他们发现，上述两种真菌诱导子对吲哚总碱及阿吗碱和长春质碱的积累均有明显的正向调节作用，并确立了真菌诱导子的最佳处理时间。

除上述研究以外，还有Shukla等[3]用瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）匀浆分别对长春花试管苗、愈伤组织和悬浮细胞进行诱导，并设定诱导持续时间为8 h、16 h和24 h，诱导后测定细胞内生物碱的含量及SGD和DAT基因的表达情况。结果显示，P. aphanidermatum匀浆不仅能使长春花试管苗、愈伤组织和悬浮细胞中总生物碱的含量日益增加，还能使SGD和DAT基因的表达上调。此外，在长春花试管苗和愈伤组织中，该真菌诱导子还能诱导长春质碱和文多灵（vindoline）的合成与积累。Tonk等[15]用不同浓度的黄曲霉（Aspergillus flavus）诱导子处理胚性长春花愈伤组织，并对愈伤组织生长率、植胚及植株再生率及生物碱（长春新碱和长春碱）含量进行了检测。结果表明，低剂量的真菌诱导子既能有效地提高愈伤组织生长率、植胚数、萌芽率及长春花植胚中的生物碱含量，也能增加胚苗和胚根的长度。进一步检测抗氧化物酶活性发现，经诱导子处理后，初生和成熟的长春花植胚中超氧化物歧化酶（SOD）活性明显升高；由此可认为低剂量的A. flavus诱导子使长春花的晚期植胚产生过敏反应，从而导致生物碱的含量有所提升。

在研究真菌诱导子对长春花TIA产量影响的同时，人们也对长春花的其他次生代谢物进行深入研究。Frankmann和Kauss[25]发现在P. aphanidermatum真菌诱导子的诱导下，阿吗碱的含量在诱导初期有所提高，并且长春花悬浮细胞中会积累2, 3-二羟基苯甲酸 （2,3-dihydroxy benzoic acid，DHBA）。与此同时，Moreno等[26]用P. aphanidermatum真菌诱导子处理长春花悬浮细胞和幼苗后也发现，无论在长春花悬浮细胞还是在长春花幼苗中，都会有DHBA在细胞内大量累积；而且，DHBA的积累量与异分支酸合酶（isochorismate synthase，ICS）的诱出量呈正相关。几年后，Muljono等[27]继续利用P. aphanidermatum诱导子研究长春花悬浮细胞中产生的DHBA是否来自水杨酸（salicylic acid，SA）。结果显示，虽然SA不太可能是DHBA的直接前体物质，但它很可能在DHBA生物合成途径中起着调控作用。

2.2 真菌诱导子的作用机制

除了研究如何提高长春花中特定生物碱含量，人们还利用真菌诱导子来进行诱导机制方面的研究。

上世纪八九十年代，Eilert等[28]用P.aphanidermatum诱导子处理长春花悬浮细胞，发现色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase，TDC） 和异胡豆苷合酶（strictosidine synthase，SS）的酶活力被瞬间激发；Roewer等[29]进一步研究发现，酶活力被瞬间激发是因为P. aphanidermatum诱导子导致了上述两种酶基因的瞬时表达。后来，在利用联合诱导法提高长春花悬浮细胞次生代谢产物产量的同时，Zhao等[30]还通过黑曲霉诱导子，发现在悬浮细胞中真菌诱导子对吲哚生物碱生物合成的诱发作用与Ca2+内流及氧化爆发（oxidative burst）密切相关。Xu和Dong[17]利用分离自真菌橘青霉（Penicillium citrinum）细胞壁的诱导子及NO特异清除剂 1,3-PBITU二氢溴酸盐（S,S’-1,3-phenylenebis(1,2-ethanediyl) -bis-isothiourea，PBITU）处理长春花悬浮细胞。研究结果说明，真菌诱导子能诱导长春花悬浮细胞中的一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）和一氧化氮合成样酶（NOS-like enzyme）合成NO，而细胞中NO的存在则是诱导长春质碱合成的关键。与此同时，他们还利用黑曲霉细胞壁诱导子处理长春花悬浮细胞，阐述了从氧化反应中间产物（reactive oxygen intermediate，ROI）的产生到苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的激活，及导致长春质碱合成的一系列信号传导过程。值得注意的是，触发后续信号传导过程的ROI是O2-而不是H2O2[31]。

随后，Tang等[32]从长春花中分离出属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）的内生真菌F9，并作用于长春花悬浮细胞培养体系，证实在真菌诱导子的作用下，悬浮细胞迅速作出应答，某些与清除自由基过程相关的信号传导通路被激活，某些特定的次生代谢途径被打开或增强。且经内生真菌诱导子处理后，长春花悬浮细胞中PAL和TDC的活性及生物碱的含量获得显著提高。

为阐明真菌诱导子调控药用植物活性成分生物合成的作用机制，Chen等[33]将分离自真菌苎麻疫霉（Phytophthora boehmeriae）的蛋白PB90作为真菌诱导子。该研究发现，用PB90处理长春花悬浮细胞后，细胞中脱落酸（ABA）和NO含量迅速增加，而细胞中的两个重要的长春质碱生物合成基因Str和Tdc的表达也随之受到促进，长春质碱的含量增至20 mg/L即原来的4倍；分别用ABA抑制剂和NO清除剂处理经真菌诱导子诱导的长春花悬浮细胞时，Str和Tdc的表达及长春质碱的生物合成却受到抑制。由此可见ABA和NO在诱导子诱导的长春质碱生物合成中起着至关重要的作用。进一步研究表明，在由PB90诱发的信号传导级联反应中，ABA在NO的上游发挥作用。

其后，人们进一步在基因水平上对真菌诱导子的调控作用进行解释。Pandey等[4]发现分离自长春花叶片的内生真菌Curvularia sp. CATDLF5和Choanephora infundibuliferaCATDLF6对长春花的初级代谢不产生影响，但能使长春花植株中文多灵的含量增加约2～4倍。qPCR结果显示，经上述内生诱导子处理后，长春花TIA途径中关键酶基因G10H、TDC、STR、16OMT、D4H、DAT、PRX1及转录激活因子基因ORCA3的表达均有所上调，而转录抑制因子基因ZCT的表达却受到抑制；根据qPCR结果推断，长春花植株中文多灵的含量增加，是因为内生真菌诱导子可特异地调控文多灵生物合成途径中关键基因的表达。

3 结语和展望

生物碱是存在于药用植物中的一类含氮杂环化合物，在疾病治疗中发挥重要作用。然而，来源于长春花的生物碱含量往往很低，且长春花植物资源有限，严重影响其在药用方面的开发利用。虽然半合成、发酵或基因工程等手段在提高生物碱产量方面均显示出巨大潜力，但限于成本偏高及环境污染等问题，从药用植物细胞中提取生物碱仍然是当前获取生物碱的主要来源[34]。现有研究证明真菌诱导子能快速、专一地诱导植物特定基因的表达，从而活化特定次生代谢途径、使目的次生代谢产物的积累量增加。因此，利用真菌诱导子提高长春花生物碱含量具有重大意义。

从已有研究可知，通过调整真菌诱导子的真菌种类、诱导子的剂量、诱导时间长短及植物细胞培养物的种类等因素，可有效地提高长春花生物碱的产量。此外，通过真菌诱导子对长春花悬浮细胞进行诱导处理，人们还对真菌诱导子的诱导机制进行了初步研究，并取得可喜进展。

但目前真菌诱导子在长春花细胞的应用主要集中于由愈伤组织（callus）继代培养而成的长春花悬浮培养细胞体系。愈伤组织又被称为脱分化细胞，是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织；而干细胞（stem cell），则是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞。与脱分化细胞对比，干细胞在生长率、稳定性、次生代谢物含量等方面表现出一定的优越性[35]。药用植物干细胞培养作为一种新技术，为解决传统细胞培养遇到的问题提供了一个全新的解决方案[36]。随着药用植物干细胞培养技术的完善与发展，如果将真菌诱导子与该技术结合起来，将会极大地推动真菌诱导子在调控药用植物次生代谢产物含量方面的研究进程。