安康 ‘紫仁’ 核桃响应干旱胁迫的生理评价研究

李大培 李生萍 高向倩 赵婷婷 张芳芳 杨桂燕

(1. 西北农林科技大学林学院，山阳核桃板栗试验示范站，陕西 杨凌 712100；2. 西北农林科技大学林学院，陕西省经济植物资源开发利用重点实验室，陕西 杨凌 712100)

核桃 (Juglansregia) 是重要的木本油料及用材树种，具有抗旱、耐瘠薄等特征，与榛子 (Corylusheterophylla)、扁桃 (Amygdaluscommunis)、腰果 (Anacardiumoccidentale) 并称为世界四大干果[1]。我国核桃种质资源丰富[2]，核桃产业已成为我国脱贫致富的重要助推器，如陕西省部分市县(商洛市、安康市等)将扶持核桃发展作为扶贫攻坚的主要战略。因此，筛选培育优质、高产、抗逆核桃品系，对促进精准扶贫工程的实施及区域经济的发展具有重大意义。 ‘紫仁’ 核桃又称为 “乌仁核桃”、 “紫瓤核桃”，以核仁颜色特殊 (内种皮多为灰褐色或紫褐色) 为其突出特点，是我国极其宝贵的核桃种质资源，主要分布在陕西、四川、云南等地，其中陕西乌米核桃为北方普通核桃类型[3-4]。安康地区 ‘紫仁’ 核桃资源丰富，开展 ‘紫仁’ 核桃研究，选育良好品系，对当地农民增收和经济发展将具有较大促进作用。

干旱是西北地区植物常见环境胁迫因子，严重时直接影响植株的生长发育、产量等。评价核桃品系是否具有优良抗性，可对其响应干旱胁迫的能力进行分析。在一定干旱阈值胁迫下，干旱首先会使得植株植物组织缺水，继而导致脯氨酸、可溶性糖等渗透压调节物质积累，同时引起膜系统分解，产生氧化产物丙二醛 (MDA)，其含量可以用于表达植物抗旱性的强弱[5-7]。因此，分析不同植物在干旱条件下的生理指标，可评价植物对干旱胁迫响应的水平。本研究选取在安康地区培育的 ‘紫仁’ 核桃进行干旱胁迫下的生理指标分析，对其抗旱能力进行综合评价，以期为选育优良的 ‘紫仁’ 核桃品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 分别种植于25 cm × 25 cm方盆中，培养至4月龄大。将10% PEG6000分别浇灌其根部进行干旱模拟处理，隔12 h浇灌一次。处理0、3、6、9、15 d后分别取材，待测，每个时间点3次重复，每个重复包含6棵植株。

1.2 测定方法

1.2.1相对电导率测定方法

蒸馏水洗净50 mL玻璃三角瓶，灭菌，烘干，用灭菌去离子水平衡24 h，在烘箱内烘干备用。对植物材料进行表面除尘，平衡及除湿。取相等面积叶片分别放入烧杯，加50 mL超纯水，保持真空15 min，用电导仪测电导率S1。将烧杯90 ℃水浴20 min，冷却至室温后测其电导率S2。采用公式 (1) 计算相对电导率。

相对电导率=S1/S2×100%

(1)

1.2.2MDA含量测定方法

采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法进行测定。按公式 (2) 计算MDA浓度，公式 (3)[8]计算每克样品中MDA含量。

C1=6.45×OD532-0.56×OD450

(2)

y1=(C1×V)/W1

(3)

式中：C1为MDA浓度 (μmol/L)；y1为每克样品中MDA含量 (μmol/g)；V1为提取液体积 (mL)；W为测定样品质量；OD532为在波长532 nm时的吸光度；OD450为在波长450 nm时的吸光度。

1.2.3酶活性测定方法

将不同处理材料用液氮研磨，根据班巧英等[8]方法测定。超氧化物歧化酶 (SOD) 测定波长为560 nm处的吸光度 (OD560)，过氧化物酶 (POD) 测定波长为470 nm处的吸光度 (OD470)。

1.2.4脯氨酸含量测定方法

根据标准品制备标准曲线[8]，取研磨样品0.1～0.2 g置于10 mL试管，加入2 mL 3%磺基水杨酸溶液，沸水浸提10 min；取出试管冷却至室温离心，取1 mL上清，并分别加1 mL冰乙酸和1.5 mL显色液，沸水浴40 min。取出冷却，向各试管加入2.5 mL甲苯充分振荡，静置分层，吸取甲苯层，测定波长为520 nm处的吸光度 (OD520)。根据标准曲线及OD520计算提取液中脯氨酸的含量C2，再按公式 (4) 计算脯氨酸浓度。

y2=(C2×V2)/(a×W2)

(4)

式中：y2为脯氨酸含量 (μg/g)；C2为提取液中脯氨酸含量 (μg)；V2为提取液总体积 (mL)；a为测定时所吸取上清体积 (mL)；W2为样品质量 (g)。

1.3 数据处理方法

实验数据使用SPSS软件分析。

2 结果与分析

2.1 细胞膜质渗透程度比较

电导率和MDA含量能反应植株在胁迫刺激下的膜质化及细胞渗透情况，是反应植株响应逆境的重要指标。由图1可知，干旱胁迫下2种 ‘紫仁’ 核桃的相对电导率随着胁迫时间延长而增大，二者区别在于6～15 d处理阶段 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 的相对电导率变化强度不同。‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 在干旱胁迫9 d时，相对电导率分别为6 d时的1.71、1.56倍，MDA含量分别为6 d时的1.15、1.23倍。 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 在干旱胁迫15 d时，相对电导率分别为9 d时的1.07、1.20倍，MDA含量均为9 d时的1.62倍。 ‘紫仁1’ 的相对电导率高于 ‘紫仁2’，在6～15 d处理下差异显著 (P< 0.05) (图1a)，表明在干旱胁迫下 ‘紫仁2’ 的细胞受损渗透程度较 ‘紫仁1’ 轻。

干旱胁迫下MDA含量变化与相对电导率变化趋势相似，MDA含量随着胁迫时间延长而增大，胁迫后 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ MDA含量分别增加为0 d的2.08～5.02倍和1.68～4.10倍。 ‘紫仁1’ MDA含量和增加程度均高于 ‘紫仁2’，且在胁迫下二者的差异显著 (P< 0.05) (图1b)，表明干旱胁迫对 ‘紫仁2’ 造成的细胞膜质化程度弱于 ‘紫仁1’。

不同小写字母表示差异显著。

图1干旱处理下的相对电导率和MDA含量
Fig.1 Relative conductivity and MDA content under drought stress

2.2 抗氧化酶活性比较

SOD和POD是植株响应逆境的重要保护酶类[8]，对其进行分析可以有效的判定不同植株之间的抗逆能力。两个 ‘紫仁’ 核桃株系在干旱胁迫时SOD活性逐渐升高，且 ‘紫仁2’ 的SOD活性高于 ‘紫仁1’，且二者在处理15 d后差异显著 (P< 0.05)。 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 在处理15 d后，二者SOD活性分别为处理0 d时的2.30、2.23倍 (图2a)。

POD活性在干旱胁迫前后的变化趋势也是随着处理时间延长而逐渐升高，但其增加幅度与SOD不同。POD活性变化较大，尤其在6～9 d时，POD活性增强幅度最大， ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 在处理9 d后POD活性分别为处理6 d后的1.77和1.73倍，处理15 d后二者POD活性分别为处理0 d的3.10、3.30倍。 ‘紫仁2’ POD活性略高于 ‘紫仁1’，但差异不显著 (图2b)。

不同小写字母表示差异显著。

图2干旱处理下的SOD和POD活性
Fig.2 The activities of SOD and POD under drought stress

2.3 脯氨酸含量变化比较

脯氨酸含量变化是植株在逆境胁迫下的重要生理反应特征，特别是干旱胁迫下，脯氨酸代谢在一定程度上即反应了植株的抗旱能力。对2个 ‘紫仁’ 核桃优良品系进行干旱胁迫处理，结果发现 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 的脯氨酸含量随着胁迫时间延长逐渐升高，且 ‘紫仁2’ 中脯氨酸含量显著高于 ‘紫仁1’ (P< 0.05)。 ‘紫仁1’ 在胁迫3、6、9、15 d后，脯氨酸含量分别为0 d的1.63、2.12、2.66、3.15倍， ‘紫仁2’ 脯氨酸含量随着胁迫时间延长而增加的现象更为明显，分别为0 d的1.96、2.48、2.99、3.40倍 (图3)。可见 ‘紫仁2’ 抗旱性比 ‘紫仁1’ 强。

不同小写字母表示差异显著。

图3干旱处理下的脯氨酸含量
Fig.3 The content of proline under drought stress

3 结论与讨论

核桃是重要木本油料植物，核桃产业的发展在很大程度上关系到不少地区百姓的经济收入。目前，我国栽植面积广泛，但核桃产业的提质增效亟待解决。要从根本上改善核桃产业的发展，优良品种显得尤为重要。目前，对优良核桃品种的选育及评价主要基于植株抗逆性和果实产量质量实现。如曹尚银等[9]对 ‘中核短枝’ 的选育就是从其出仁率和抗病抗冻性等方面进行了综合评价。张辉元等[10]对‘陇薄香2号’ 的选育也综合考虑了营养成分、出油率、丰产性、抗逆性等。王金贵等[11]对2个核桃优良单株 ‘朝核1号’、 ‘朝核2号’ 的经济指标及抗旱抗寒性进行分析，比较了二者的综合优势。安康地区广泛分布 ‘紫仁’ 核桃，是当地发展核桃产业的重要品种。筛选和培养适应性强、生长旺盛、产量大的优良品系进行推广应用是推动当地核桃产业发展的重要途径。因此，要鉴定适宜的优良品种，也需要从抵抗当地较为突出的环境因子方面进行考虑。

本研究对安康地区培育的 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 2个优良品系进行干旱胁迫下的生理响应分析，探明其抵抗干旱胁迫的响应能力及抗旱适应性，为确定 ‘紫仁’ 核桃优良品系打下基础。结果显示，在干旱胁迫下， ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 的脯氨酸含量、SOD和POD活性、MDA含量及相对电导率均明显提高，说明干旱胁迫对2个 ‘紫仁’ 核桃品系均造成了有效的刺激，使得细胞产生了一定的膜质化和损伤，造成了细胞渗透性提高。而同时， ‘紫仁’ 核桃也启动了响应干旱胁迫的应对机制，脯氨酸代谢通路的激活、保护酶活性的提高，都表现出 ‘紫仁’ 核桃应对干旱胁迫的积极应答响应。同时， ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 在干旱胁迫下的生理响应变化趋势相似，但却有明显的差别。 ‘紫仁1’ 在胁迫后的MDA含量及相对电导率显著高于 ‘紫仁2’ (P< 0.05)，说明在相同胁迫条件下， ‘紫仁1’ 受损伤和膜质化程度高于 ‘紫仁2’；而 ‘紫仁1’ 的脯氨酸含量、SOD和POD活性却又低于 ‘紫仁2’，说明 ‘紫仁1’ 在干旱胁迫下脯氨酸及保护酶调节抗旱的能力弱于 ‘紫仁2’， ‘紫仁2’ 比 ‘紫仁1’ 的抗旱性强。这与侯栋等[12]研究 ‘香玲’、 ‘丰辉’、 ‘鲁光’、 ‘元林’ 等四个核桃品种响应干旱胁迫的生理变化趋势相似，与干旱胁迫调节这4个核桃品种的脯氨酸和MDA含量增加以及SOD和POD活性增强的研究结果一致。余甜等[13]对新疆3种野生核桃进行干旱胁迫响应能力分析，发现干旱胁迫下MDA和脯氨酸含量均明显升高。陈永坤等[14]采用PEG6000人工模拟干旱胁迫对漾濞核桃幼苗MDA和游离脯氨酸等的含量变化进行研究，结果表明这些指标综合反映了核桃幼苗的抗旱性。徐颖等[15]以‘香玲’核桃为参照，通过比较抗寒性和适应性，选育出避晚霜新品种 ‘秋香’。可见，通过分析 ‘紫仁1’ 和 ‘紫仁2’ 的抗旱能力，有效比较二者的抗旱性。

综上所述， ‘紫仁’ 核桃在响应干旱胁迫时能有效的启动脯氨酸调节通路，抗氧化酶保护调节。 ‘紫仁2’ 比 ‘紫仁1’ 的抗旱性强。本研究可为进一步筛选和培育优良抗逆核桃品系，特别是安康地区推广应用 ‘紫仁’ 核桃提供参考依据。

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