栽培密度对党参产量和次生代谢物含量的影响

靳鹏博，胡佳栋，毛歌，张志伟，马存德，梁宗锁，董娟娥*

(1.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710000；3.浙江理工大学，浙江 杭州 310000)

药用植物次生代谢物是中药治疗疾病的重要物质基础[1]。次生代谢物的合成积累对生长环境的依赖性很强，其种类和含量因地域、气候和采收期的不同有较大的差异[2]。密度是影响次生代谢的重要因素。研究表明，不同的栽培密度下丹参(Salviamiltiorrhiza)的次生代谢物含量不同，20 cm×25 cm密度条件下丹参的次生代谢物含量最高[3]。栽培密度为株行距7 cm×30 cm时，防风(Saposhnikoviadivaricata)根中的4种主要有效成分的含量均显著高于其他栽培处理[4]。除影响次生代谢物含量外，合理密植也是获得高产的重要途径之一。栽培密度不仅影响作物单位面积上的最大物质产量，而且对作物根系的形态特征、生长发育也有重要影响[5-8]。

不同生育期药用植物的干物质和次生代谢物的积累量存在明显差异，因此合理采收对控制药材的产量品质起着重要的作用。研究表明，川芎(Ligusticumchuanxiong)中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯的含量在4月30日至5月5日最高[9]。老鸦瓣(Tulipaedulis)地下部分生物量在果实成熟期最大，随后的生物量持续减小[10]。过早或过晚的采收期将造成药材产量下降、有效成分不符合国家药典标准，因此合理采收对高产优质的药材生产具有重要意义。

党参为桔梗科植物党参(Codonopsispilosula)、素花党参(Codonopsispilosulavar.modesta)或川党参(Codonopsistangshen)的干燥根。味甘、性平，归脾、肺经，具有健脾益肺，养血生津等诸多功效[11]。党参的主产区位于我国甘肃、陕西、山西等地，不同产区的环境、气候、海拔等条件不尽一致[12]，对于党参高产栽培技术的研究已有报道，各地栽培方法、水肥水平、栽培密度和管理方式等不尽相同[13-16]。因此，在党参道地产区开展规范化栽培技术研究很有必要。本研究通过对不同栽培密度下不同生长期的党参产量与次生代谢物含量进行测定，旨在明确栽培密度对不同采收期党参产量和质量的影响，提出甘肃宕昌地区党参生长的适宜栽培密度和合理采收时期，为党参规范化栽培提供技术支持，也为现有土地资源的提质增效、提高土地利用率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用幼苗为一年生素花党参幼苗，由陕西步长制药有限公司甘肃宕昌GAP基地提供。

1.2 仪器和试剂

仪器：RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；DK-S26电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司)；UV-1800紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；超纯水仪(上海优普超纯水公司)；超声波清洗机(浙江宁波超声波仪器公司)；Waters1525 系列 HPLC 系统，DAD 检测器，Agilent C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，C18保护柱(20 mm×4.6 mm，5 μm)，Empower II色谱工作站(美国 Waters 公司)。

试剂：党参炔苷购于上海中药标准化研究中心；色谱级甲醇和乙腈(美国 Fisher 公司)；丙三醇(广州光华科技股份有限公司)；葡萄糖、蒽酮、3,5-二硝基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司)；浓硫酸(西陇化工有限公司)；无水乙醇(成都科龙化工试剂厂)；本试验所用其他试剂均为分析纯。

1.3 研究地区概况

试验地点为陕西步长制药有限公司甘肃宕昌GAP基地，位于甘肃省陇南市宕昌县阿坞乡，该地海拔2400 m，年均日照时数1986.5 h，年均降水量450 mm，年均气温10 ℃，年均无霜期180 d，最大冻土深度45 cm，前茬作物为马铃薯(Solanumtuberosum)。将试验田的杂草清除后，耕地，进行移栽前土壤分析：pH 7.96、有机质29.58 g·kg-1、全氮1.547 g·kg-1、碱解氮75.61 mg·kg-1、全磷0.4695 g·kg-1、速效磷23.85 mg·kg-1、全钾29.6 g·kg-1、速效钾357.70 mg·kg-1。

1.4 试验设计

试验共设置5个密度处理：A(50株·m-2，行距20 cm×株距10 cm)，B(33.3株·m-2，行距20 cm×株距15 cm)，C(25株·m-2，行距20 cm×株距20 cm)，D(33.3株·m-2，行距30 cm×株距10 cm)，E(22.2株·m-2，行距30 cm×株距15 cm)，芦头向东，移栽深度10～15 cm。每个处理设3个重复，随机区组，共计15个小区。各试验小区为5 m×3 m。各处理党参均于2016年3月中旬移栽，生长期不施肥。各处理田间除草、病虫害及水分管理措施一致。

1.5 测定指标与方法

1.5.1农艺性状指标和产量的测定 采样分3次进行：分别为2016年8月30日、9月30日(传统采收期)[13]和10月20日，每次采样量为每小区10株，将植株完整的连根挖出后，搓去泥土，分别测定根长、根最大直径和单根鲜重。经105 ℃杀青后，置于阴凉通风处干燥，至水分含量达16%以下时测其单根干重[11]，由种植密度与单株根干重换算出产量(kg·hm-2)。将干燥后的药材粉碎，过0.18 mm筛，备用。

1.5.2党参炔苷的提取和含量测定 党参炔苷含量采用高效液相色谱法测定[17]。

1)色谱条件。色谱柱：Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶水(28∶72，v/v)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长为267 nm，柱温30 ℃；进样量20 μL。

2)对照品溶液的制备：准确称取党参炔苷标准品1.0 mg，以甲醇溶解并配成0.50 mg·mL-1的标准品溶液。

3)供试样品溶液的制备：准确称取干燥的党参粉末0.3 g，置于具塞锥形瓶中，加50 mL甲醇，精密称定重量，记录。超声处理30 min后放冷，称重，加甲醇补足减失的重量。摇匀静置，取上清，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得。

4)标准曲线：取上述党参炔苷对照品溶液，稀释为48、24、12、6、3、1.5、0.75和0.375 μg·mL-1，进样20 μL。绘制标准曲线：以峰面积为横坐标(A)，以浓度为纵坐标(B)，回归方程为：B=0.000044810A+0.144534179,R2=0.9999。良好的线性关系发生在0.375～24.000 μg·mL-1浓度范围。

5)党参炔苷产量：

党参炔苷产量(g·hm-2)=党参炔苷含量(mg·g-1)×党参产量(kg·hm-2)×1(g2·mg-1·kg-1)

1.5.3党参多糖的提取和含量测定 分别使用蒽酮-浓硫酸法和3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitro-salicylic acid，DNS)法测得溶液中总糖和还原糖的质量浓度，然后根据党参多糖质量浓度为党参总糖质量浓度和还原糖质量浓度之差[18]，得出党参多糖的质量浓度。

1)总糖提取液的制备：于10 mL离心管中准确装入0.5 g党参粉末，加8 mL蒸馏水，混匀，置于80 ℃水浴30 min，超声提取10 min，7000 r·min-1离心5 min，回收上清至50 mL容量瓶，加8 mL蒸馏水溶解沉淀，重复以上步骤两次，合并所有上清，定容至50 mL，即为总糖提取液。

2)标准曲线的绘制。蒽酮-浓硫酸法：精确称取干燥葡萄糖标准品1.0000 g，使用蒸馏水定容至100 mL，配置成质量浓度为10 mg·mL-1葡萄糖母液，精密吸取葡萄糖母液1 mL至100 mL容量瓶，蒸馏水稀释定容，配置成质量浓度为0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准品溶液。取7只5 mL比色管，编号1～7，分别加入葡萄糖标准溶液0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL，随后依次加入4.0 mL 0.2%蒽酮-浓硫酸试剂，摇匀，置于沸水浴5 min，冷却后用浓硫酸定容到5 mL，静置10 min，以1号比色管为空白对照，测定各管A620。绘制标准曲线：以吸光度为横坐标(A)，葡萄糖标准品质量浓度(μg·mL-1)为纵坐标(B)，回归方程为：B=26.433A-0.0819，R2=0.9994，良好的线性关系发生在8.01～20.02 μg·mL-1浓度范围。

DNS法：精确称取干燥葡萄糖标准品100.0 mg，使用蒸馏水定容至100 mL，配置成质量浓度为1.0 mg·mL-1的葡萄糖标准品溶液。取8只10 mL比色管，编号1～8，分别加入葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 mL，随后各管补加蒸馏水至2 mL，并分别添加1.5 mL DNS试剂，混匀，置于沸水浴5 min，冷却后定容至10 mL，混匀，静置20 min，以1号为空白对照，测定各管A540。绘制标准曲线：以吸光度为横坐标(A)，葡萄糖标准品质量浓度(μg·mL-1)为纵坐标(B)，回归方程为：B=102.4A+1.508，R2=0.9996，良好的线性关系发生在20.01～90.02 μg·mL-1浓度范围。

3)样品总糖、还原糖质量浓度的测定采用蒽酮-浓硫酸法[18]，分别取0.5 mL稀释50倍的提取液测定总糖质量浓度，分别取0.4 mL用DNS法[18]测还原糖质量浓度，多糖质量浓度=总糖质量浓度-还原糖质量浓度，将算得的多糖质量浓度换算为多糖含量(%)。

4)党参多糖产量：

党参多糖产量(kg·hm-2)=党参多糖含量(%)×党参产量(kg·hm-2)/100%

1.5.4醇溶性浸出物测定 提取剂使用45%的乙醇，按照《中国药典》[11]2015年版通则中2201“浸出物测定法”，对党参醇溶性浸出物含量进行测定。

1.6 数据处理

数据处理使用Microsoft Excel 2003；采用SPSS 24.0软件进行数据显著性检验(P<0.05)和Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同栽培密度对党参生长的影响

图1 不同栽培密度的党参鲜根长Fig.1 The length of roots of C. pilosula with different planting density 同一时期不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。Different small letters in the same stage mean significant difference (P<0.05), the same below.

2.1.1不同栽培密度对党参根长的影响 不同栽培密度对党参鲜根长的影响见图1。8月30日，根长最长的是处理C(20.75 cm)，其次是处理E，处理D和处理A根长显著小于处理C与D。低密度栽培的党参根长值高于高密度的党参，可能是因为高密度栽培的党参出现了种内竞争[8,14]。9月30日，处理A、B和E的党参根长较长，显著高于处理D；10月20日，各密度栽培的党参根长差异不显著，9月30日-10月下旬党参地下部分仍在生长，为快速增重期[14]。同一栽培密度下，根长最大的均为10月20日采收的党参，说明随着生长时间的延长党参的根长在不断增加。

2.1.2不同栽培密度对党参根最大直径的影响 不同栽培密度对党参鲜根粗的影响见图2。低密度处理的根最大直径值高于高密度处理，这可能是因为7月初至9月中旬，为根体积增加的重要时期，随着生长进程，茎叶生长达到较大的量，根部体积迅速增加，群体的光、温、水和养分竞争加剧，密度效应凸现，高密度栽培的党参种内竞争相比低密度的强很多[14]。9月30日，处理B的根最大直径值最大，处理E和A次之，处理C和D最小；10月20日，各密度处理的党参根最大直径差异不显著，但均大于9月30日采集的样品。同一栽培密度下，根直径最大的均为10月20日采收的党参，说明随着生长时间的延长党参的根粗在不断增加。

2.1.3不同栽培密度对党参根鲜重的影响 不同栽培密度对党参根鲜重的影响见图3。各栽培密度下，党参的根鲜重随生育进程的增加而增加，在10月20日党参根鲜重达到最大。8月30日，根鲜重最大的是处理E(3.09 g)，处理A的最小，差异显著。9月30日，低密度处理的根鲜重也明显高于高密度处理；10月20日，处理C显著低于处理A、B。

2.2 不同栽培密度对党参次生代谢物含量的影响

2.2.1不同栽培密度对党参炔苷含量的影响 不同栽培密度对党参炔苷含量的影响见图4。党参炔苷是党参中最重要的次生代谢物，也是党参的指标成分。由于8月党参还处于花铃期[5]，不能作为成品使用，仅考虑9月30日和10月20日的党参炔苷含量。9月30日，处理C、D和E的党参炔苷含量显著大于处理A。在株距一定的情况下，行距较大的党参炔苷含量高于低行距。低密度处理的党参炔苷含量高于高密度处理。10月20日，各处理的党参炔苷含量差异不显著。10月20日，处理A和处理B的党参炔苷含量高于9月30日的样品。

2.2.2不同栽培密度对党参多糖含量的影响 不同栽培密度对党参多糖含量的影响见图5。党参多糖是党参中最重要的次生代谢物。9月30日，党参多糖含量最高的是处理E(41.46%)，处理C次之，处理A(36.20%)最低。低密度处理的党参多糖含量高于高密度处理。9月30日至10月20日，除处理A的多糖含量有所上升外，其他处理均下降。

图3 不同栽培密度的党参根鲜重Fig.3 The fresh weight of roots of C. pilosula with different planting density

图4 不同栽培密度的党参炔苷含量Fig.4 The content of lobetyolin in C. pilosula with different planting density

图5 不同栽培密度的党参多糖含量Fig.5 The content of polysaccharide in C. pilosula with different planting density

2.2.3不同栽培密度对党参醇溶性浸出物含量的影响 不同栽培密度对党参醇溶性浸出物含量的影响见图6。《中国药典》2015年版规定党参药材醇溶性浸出物含量不得少于55.0%[11]。由图6可知，不同密度不同时期的党参醇溶性浸出物含量均符合药典规定。各采样时期醇溶性浸出物含量最高的是处理B(74.99%)，在该密度下，10月20日采集的各样品中醇溶性浸出物含量均高于60%，符合药典规定。

2.3 不同栽培密度对党参产量的影响

不同栽培密度对党参产量的影响见图7。9月30日，党参产量最大的是处理E，最低的是处理C，低密度处理的产量略高于高密度处理。8月中旬-9月中旬，进入生殖生长和营养生长并进时期[19]。这个时期群体的光、温、水和养分竞争加剧，密度效应凸现。10月20日采收的党参，处理A的产量最高，为1266.7 kg·hm-2，较处理E增加了19.70%，且差异显著。9月中旬-10月中下旬，为极快速增重期[14]，根不断往深处生长，种内竞争减小，密度效应减弱，高密度栽培的党参有足够的营养用于根的增重，使其产量高于低密度栽培的党参。相同栽培密度下，10月20日的产量均高于9月。

图6 不同栽培密度的党参醇溶性浸出物含量Fig.6 The content of ehanol-soluble extracts in C. pilosula with different planting density

图7 不同栽培密度的党参产量Fig.7 The yield of C. pilosula with different planting density

2.4 不同栽培密度对党参采收期的影响

合理的采收期的确定要充分考虑产量与有效成分含量等各方面的因素。实际生产中，在有效成分含量达到药典要求的基础上，产量越高，经济效益越高。为了实现经济效益的最大化，可同时兼顾产量与有效成分(或指标性成分)含量确定合理的采收期。

不同采样时间单位面积党参炔苷产量见表1。高密度处理(A，B)10月20日的党参炔苷产量显著大于9月30日，而低密度处理(C～E)10月20日的党参炔苷产量小于9月30日。10月20日的党参多糖产量显著大于9月30日。考虑到10月20日产量更大，且醇溶性浸出物含量高于中国药典规定(图6)，可确定10月20日为本试验区党参合理的采收期。

表 1 不同采收期党参次生代谢物产量Table 1 The product of the secondary metabolites of C. pilosula in different harvest time

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different small letters mean significant difference (P<0.05).

3 讨论

在栽培密度对丹参、防风、红芪(Hedysarumpolybotrys)等药用植物的研究中发现，合理的栽培密度能够有效提高药用植物的产量，并可促进药用植物有效成分的累积[3-4,8,14]。另有研究发现，高密度栽培容易导致植物的密度效应，植物竞争养分、水分、光和物理空间，植物个体的生物量减小[20]。例如，甘草(Glycyrrhizauralensis)根、地上部分及根茎干质量随栽培密度增大而呈减小的趋势[21]。但在一定密度范围内，甘草群体生物量仍随密度增大而增加[22]，因此，合理的栽培密度可提高药用植物的群体生物量，对增加产量具有十分重要的作用。本研究中，8月中旬-9月中旬，党参进入生殖生长和营养生长并进时期，密度效应凸现[8,12]，低密度处理的党参个体生物量高于高密度处理。9月中旬-10月中下旬为植物的极快速增重期[12]，根系不断往深生长，种内竞争相对减小，密度效应减弱，使得高密度栽培的党参有足够的营养用于根的增重。因此，不同密度处理的党参在10月20日表现出个体生物量差异不显著。在党参栽培时，不仅要考虑个体产量，更重要的是要考虑群体产量。群体产量是个体产量与密度乘积[23]，应以群体产量为目标确定合理的栽培密度[24]。

合理的栽培密度不仅可以最大程度地提高中药材的产量，提高经济效益，还可以在一定程度上提高药用植物次生代谢物的含量[8]。本研究发现，9月30日时，低密度处理的党参炔苷和多糖含量高于高密度处理。这是因为低密度处理密度效应弱甚至没有，利于党参的生长，使党参的碳代谢非常旺盛，积累了更多的底物用以合成党参炔苷和党参多糖[25-27]。10月20日，各密度处理的党参炔苷和多糖含量差异不显著。当根系深度达到一定程度，密度效应减弱[8,12]，高密度栽培的党参同样产生大量底物用以合成党参炔苷和党参多糖。综合各项指标认为，在栽培密度为行距20 cm、株距10～15 cm时，有利于党参达到高产优质。

采收期是影响中药材产量与质量的重要环节，合理采收期的确定要充分考虑产量与有效成分含量等各方面的因素。群体产量是个体产量与密度相乘之积[23]，尽管各栽培密度水平下，低密度党参的单株生物量较大，但由于单位种植面积的植株数较少，低密度种植的产量均显著低于高密度[28]。本研究为了同时兼顾产量与有效成分(或指标性成分)含量[29]，使用成分含量与产量的乘积将产量与品质相联系，以确定实验区党参合理的采收期。结果表明，高密度处理的党参在10月20日的党参炔苷含量与产量乘积和党参多糖含量与产量乘积均显著大于9月30日，各密度处理的党参炔苷含量均符合《中国药典》要求。实际生产中，在有效成分含量达到药典要求的基础上，产量越高，经济效益越高[8,30-31]。考虑到10月20日产量更大，党参炔苷含量符合药典规定，此时收获可实现经济效益的最大化。因此，可考虑10月20日为本试验区党参合理的采收期。

4 结论

栽培密度对党参产量和次生代谢物含量均有较大程度的影响。在甘肃宕昌地区，党参栽培密度为20 cm×10～15 cm时可实现党参品质与产量的最优。该地区药农沿袭下来的传统党参采收期为9月下旬至10月上旬，此时党参的地下部分仍在生长，没有达到最大产量。在浸出物含量符合《中国药典》要求下，10月中下旬应为该地区党参的合理采收期。

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