顶空固相微萃取/GC-MS分析鉴定大蜡螟雄性信息素成分

刘位芬， 梁 铖， 苗春辉， 杨 爽，2

(1.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101； 2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

大蜡螟(GalleriamellonellaL.)属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)蜡螟亚科(Galleriinae)蜡螟属(GalleriaFabricius)昆虫，在我国1年发生2～5代，世代重叠，每个世代都经历卵、幼虫、蛹和成虫4个发育阶段，幼虫(别称巢虫)以蜜蜂巢脾为食，容易在群势较弱的蜂群和长时间存放不加以处理的巢脾上孳生，钻蛀隧道、吐丝做茧、破坏巢脾，使蜜蜂幼虫和蛹都受到伤害，造成大量“白头蛹”，为害轻时，子脾受损、群势减弱、产蜜量减少；为害严重时，扰乱蜜蜂在蜂群中的正常活动，使成蜂无法安身，导致蜂群(中华蜜蜂)飞逃，给养蜂生产造成严重的经济损失[1-3]。

目前，防治大蜡螟的方法有物理的、化学的、生物的和饲养管理等。物理防治是对巢脾进行冷冻、冷藏、加热和射线等处理，此法对贮存巢脾效果较好，但对设施要求较高；化学防治是采用硫磺、甲酸、乙酸、氯化钙、二溴化乙烯、溴代甲烷及二氯苯等药剂进行防治，长期用药不符合蜂产品无公害生产的要求；在生物防治上主要采用蜡螟绒茧蜂、线虫和苏云金芽孢杆菌等寄生性天敌对大蜡螟幼虫进行防治，但此法对大蜡螟成虫不起作用；在饲养管理方面，通过保持蜂群强壮的群势，定期清扫蜂箱、更换巢脾、安装巢虫阻隔器等措施，效果虽好但费工费时，不利于养蜂机械化和规模化生产，因此迫切须要寻求新的大蜡螟防治技术[4]。

利用昆虫性信息素防治害虫是一项极具前景的绿色防治技术，在国内外均已有成功实例，但在国内对防治大蜡螟方面还未见报道。对大蜡螟性信息素成分的研究已有报道，Roller等从大蜡螟雄蛾翅腺鉴定出第1种性信息素成分十一烷醛(n-undecanal)[5]；Leyrer等鉴定了第2种大蜡螟雄性信息素成分壬醛(n-nonanal)，并报道壬醛和十一烷醛的比率为 7 ∶3，该混合物能刺激引起大蜡螟雌蛾的求偶行为，壬醛在这一过程中占主导地位[6]；Schmidt等利用人工合成性信息素的方法进一步证实了壬醛和十一烷醛的存在，但蜂场试验结果表明，按7 ∶3比例混合的壬醛和十一烷醛混合物并不能有效地引诱雌蛾，推测大蜡螟性信息素还含有其他成分[7]；Svensson等研究报道了第3种大蜡螟雄性信息素5，11-二甲基-二十五烷，并人工合成其4种立体异构物，但这3种雄性信息素的混合物吸引雌蛾水平依然远低于自然状态下雄蛾释放性信息素的引诱力[8]。目前，国内有关大蜡螟性信息素成分的研究尚未见报道，但国外已有相关报道，例如，Lebedeva等研究报道俄罗斯不同地区间大蜡螟性信息素成分存在差异[9]。因此，本研究采用全自动顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，简称HS-SPEM)和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer，简称GC-MS)法对山西省晋中地区大蜡螟外激素成分进行初步分析鉴定，以期为今后更好地利用性信息素对大蜡螟进行防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 大蜡螟雌、雄蛾由山西农业大学养蜂学实验室提供，试验前2 h取刚羽化的雌、雄蛾各10头，剪去其翅膀(保持活体)，转入20 mL顶空瓶中，密闭瓶口。

1.1.2 仪器 检测试验全部在山西农业大学实验教学中心完成，仪器有美国Thermo Fisher公司气相色谱-质谱联用仪(Trace ISQ型GC-MS联用仪)、美国CTC公司转盘式自动进样器(G6500型)、美国Supelco公司固相微萃取装置，萃取纤维头为65 μm PDMS/DVB。

1.2 方法

1.2.1 外激素成分的提取 检测前先将PDMS/DVB萃取纤维在GC进样口250 ℃老化1 h。自动进样器条件为：50 ℃保持15 min，50 ℃吸附5 min，解吸附5 min，分析时间为 60 min，每个样品重复2次。

1.2.2 GC-MS分析条件 HP-5MS弹性石英毛细管柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气，纯度≥99.99%，柱流量为1.0 mL/min；升温程序：初始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至270 ℃，保持6 min；不分流进样，进样量为2 μL。MS条件：离子源温度为 230 ℃，发射电流为34.6 μA，转接口温度为280 ℃，电子倍增器电压为350 V，全扫描采集，采用氢火焰离子化检测器(flame ionization detector，简称FID)进行检测。

2 结果与分析

按照GC-MS分析条件分别对大蜡螟雌、雄蛾外激素挥发性成分进行分析，得到总离子流色谱(图1、图2)，外激素成分分析结果如表1、表2所示。通过GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在标准谱库进行检索，得出分析报告(100个峰)，根据质谱匹配度分别对大蜡螟雌、雄蛾外激素组分进行核对(要求匹配率>20%)。

表1 大蜡螟雄蛾外激素组分的GC-MS分析结果

由表1可知，在大蜡螟雄蛾提取物中共鉴定出挥发物外激素成分8种，占总提取物的18.66%，其中酮类占8.29%(5种)，醇类占10.25%(2种)，醛类占0.12%(1种)；1种8碳化合物(1.18%)、3种9碳化合物(7.26%)、1种10碳化合物(0.65%)、2种11碳化合物(3.60%)、1种18碳化合物(5.97%)。由表2可知，在大蜡螟雌蛾提取物中鉴定4种挥发物外激素成分，占总提取物的1.29%，其中1种醇类，3种酮类，分别是乙醇(0.45%)、辛酮(0.34%)、壬酮(0.21%)和癸酮(0.29%)。

通过对比成分发现，雄蛾外激素种类和含量明显较雌蛾

表2 大蜡螟雌蛾外激素组分的GC-MS分析结果

多；酮类外激素组分辛酮、壬酮和癸酮为大蜡螟雌、雄蛾共有组分；乙醇为雌蛾特有成分，但壬醛、十一烷醇(酮)和6，10，14-三甲基十五烷酮-2为大蜡螟雄蛾特有成分，鉴于昆虫性信息素成分多为不饱和烃，推测壬醛、十一烷酮和6，10，14-三甲基十五烷酮-2为大蜡螟雄性信息素组分(分子结构如图3)。

3 结论与讨论

本研究通过顶空固相微萃取与GC-MS初步测定山西省晋中地区大蜡螟雌、雄蛾外激素挥发物成分的差异，经成分差异对比推测大蜡螟雄性信息素组分为壬醛(nonanal)、十一烷酮(醇)(2-undecanone)和6，10，14-三甲基十五烷酮-2(2-pentadecanone)，这与国外研究报道的大蜡螟雄性信息素成分[5-8]略有差异。在此次检测中未检测到十一烷醛(n-undecanal)和5，11-二甲基-二十五烷，但检测出十一烷酮和十一烷醇，这可能与试验中取样时间和检测条件不同有关。同时在试验中检测出壬醛与十一烷酮的量都较小，分别为 0.12%、0.27%，比率接近3 ∶7，这与Leyrer等研究报道的壬醛占主导地位的结论[6]不符，表明不同地区间大蜡螟性信息素组分存在一定的差异。对于国内外不同地区大蜡螟的种类及信息素成分的差异有必要进行深入研究。

目前，利用昆虫性信息素防治害虫是害虫综合治理对策的有效途径之一，因其高效、无毒、无污染、不伤害天敌昆虫，不会像化学农药产生环境污染及“3R”现象，被称为“第3代绿色农药”，有着巨大的发展前景[10]。检测中发现，6，10，14-三甲基十五烷酮-2的比率较高，达到5.97%，分别为壬醛和十一烷酮的49.75、22.11倍，推测6，10，14-三甲基十五烷酮-2在大蜡螟羽化初期发挥了重要作用。因此，在今后养蜂生产实践中，可以针对6，10，14-三甲基十五烷酮-2这一雄性信息素设计引诱剂或驱避剂对大蜡螟雌蛾进行防控。

[1]胡福良，李英华. 大蜡螟的生物学特性和防治方法[J]. 养蜂科技，2000(1)：4-6.

[2]Ellis J D，Graham J R，Mortensen A. Standard methods for wax moth research[J]. Journal of Apicultural Research，2013，52(1)：1-17.

[3]代平礼，周 婷，王 强，等. 大蜡螟的研究概况及防治[C]//中国养蜂学会蜜蜂产品专业委员会、蜜蜂保护专业委员会、蜜蜂授粉专业委员会联合工作会议和学术研讨会论文集. 2005.

[4]杨 爽，张学文，宋文菲，等. 大蜡螟生物学特性及其防治研究概述[J]. 中国蜂业，2016，67(3)：33-37.

[5]Roller H，Biemann K，Bjerkb J S，et al. Sex pheromones of pyralid moths—Ⅰ. Isolation and identification of the sex-attractant ofGalleriamellonella(L.) (greater wax moth)[J]. Acta Entomologica Bohemoslovaca，1968，65(3)：208-213.

[6]Leyrer R L，Monroe R E. Isolation and identification of the scent of the moth，Galleriamellonella，and a revaluation of its sex pheromone[J]. Journal of Insect Physiology，1973，19(11)：2267-2271.

[7]Schmidt S P，Monroe R E. Biosynthesis of the waxmoth sex attractants[J]. Insect Biochemistry，1976，6(4)：377-380.

[8]Svensson G P，Gündüz E A，Sjöberg N，et al. Identification，synthesis，and behavioral activity of 5，11-dimethylpentacosane，a novel sex pheromone component of the greater wax moth，Galleriamellonella(L.)[J]. Journal of Chemical Ecology，2014，40(4)：387-395.

[9]Lebedeva K V，Vendilo N V，Ponomarev V L，et al. Identification of pheromone of the greater wax mothGalleriamellonellafrom the different regions of Russia[J]. IOBC Wprs Bulletin，2002，25(9)：229-232.

[10]马 涛，张 蒙，朱雪姣，等. 螟蛾总科昆虫性信息素活性组分及结构特征[J]. 生态学杂志，2013，32(12)：3378-3384.