猪传染性胃肠炎病毒RT—PCR诊断方法的建立与应用

许瑞胜 冯淑萍 李剑静 熊毅 马琳

摘要 为建立一种快速简便的检测猪传染性胃肠炎的RT-PCR方法，根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列设计1对引物，并以合成的cDNA为模板，初步建立了猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR检测方法，进而对对照病毒及采集的病料组织进行了敏感性、特异性和重复性检测。结果表明，该研究建立的RT-PCR方法敏感性高，最低核酸检测值为0.5ng/μL，扩增产物特异性好，重复性稳定，可应用于猪传染性胃肠炎病毒的实验室诊断和流行病学调查。

关键词 猪传染性胃肠炎病毒；RT-PCR；诊断；流行病学调查

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）04-229-02

猪传染性胃肠炎是一种高度接触性传染病[1]，由猪传染性胃肠炎病毒感染引起，可以感染任何年龄段的猪，对15日龄左右的仔猪的危害最大，死亡率可达100%。5周龄以上的仔猪感染发病后死亡率较低，但会影响其后期生长发育，降低饲料利用率[2]。1946年美国学者首次报道猪传染性胃肠炎，我国于1964 年首次分离到TGEV[3]，直到目前，我国大部分地区都存在该病毒。TGEV患病猪出现水样腹泻、脱水等主要症状，多发于冬春寒冷季节，目前仍是造成仔猪发病和死亡的主要疫病之一，给养殖业造成极大损失。

本研究根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白基因（N基因）的核苷酸序列设计1对引物，建立了一种RT-PCR诊断方法，将本实验室收集到的临床病例组织病料和对照病毒为研究对象，对诊断方法进行验证。结果表明，建立的RT-PCR诊断方法快速、准确、敏感，有助于猪传染性胃肠炎的流行病学调查研究。

1 材料与方法

1.1 试验病料及对照病毒

收集2012—2014年广西9个地市58个猪场疑似仔猪腹泻的仔猪肠系膜淋巴结或肠样粪便样品506份；对照病毒TGEV和PEDV为中牧实业股份有限公司生产的猪传染性胃肠炎、猪传染性胃肠炎二联活疫苗（HB08株+ZJ08株，批号为1706004-2），CSFV和HP-PRRSV为广东永顺生物制药股份有限公司生产的猪瘟活疫苗（传代细胞源，批号为2016023），高致病性猪繁殖与呼吸综合征（GDr180株，批号为2017004）；口蹄疫O型、A型、亚洲I型抗原购自兰州兽医研究所。

1.2 主要試剂

主要试剂包括RNA酶抑制剂、M-MuLV反转录酶、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、MgCl2，购自宝生物工程（大连）有限公司，以及Trizol、氯仿、异丙醇等。

1.3 引物设计

根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0引物设计软件设计了针对TGEV N基的诊断引物。基因序列如下，TGEV-N1：5′-CCA-ACGTAAAGAGCTTCCTGA-3′，TGEV-N2：5′-TTGCTGTTG-TTTTTCTGTGTC-3′，预期目的片段大小为388 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 样品处理及总RNA的提取

将病料组织剪碎并研磨，以1∶5的体积比的量加入灭菌PBS（pH=7.2）混匀，制成悬液。-20℃反复冻融3次，于4 ℃ 8 000 r/min 离心10 min，取上清液，过0.22 μm一次性滤膜后冰冻于-70℃冰箱备用。取300 μL上述上清液于1.5 mL无RNA酶离心管中，采用Trizol法提取总RNA，每管加入500μL Trizol混匀，于室温下作用10 min，加入160 μL氯仿，于室温下作用3 min；于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；吸取400 μL上清液，加入等体积异丙醇混匀，于室温下作用10 min；于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇，8 000 r/min离心5 min；弃去乙醇，超净工作台中自然晾干，加入30 μL 0.1%DEPC水并于55～60 ℃中孵育即可得到病毒总RNA。其他对照病毒的总RAN参照以上方法获得。

1.5 cDNA合成

cDNA的合成采用25 μL体系，其中含5×buffer 5.0 μL，终浓度为1×；200 U/μL M-MuLV反转录酶0.5 μL，终浓度为4 U/μL；40 U/μL RNA酶抑制剂0.5 μL，终浓度为0.8 U/μL；10 mmol/L dNTP混合液2 μL，终浓度为0.8 mmol/L；50 μmol/L TGEV-N2 1 μL，终浓度为2 μmol/L；病毒总RNA16 μL。

1.6 PCR反应

PCR反应采用25 μL体系，其中含10×buffer 2.5 μL，终浓度为1×；25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，终浓度为1.5 mmol/L；1 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，终浓度为0.004 U/μL；50 μmol/L PED上、下游引物（TGEV-N1、N2）各0.5 μL，终浓度为1 μmol/L；10 mmol/L dNTP混合液0.5 μL，终浓度为0.2 mmol/L；待检样品cDNA 5 μL；灭菌双蒸水14.4 μL；总体积为25 μL。所有试剂加入离心管后瞬时离心混匀，置于PCR仪中按如下反应程序进行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行30个循环；然后72 ℃ 10 min；4 ℃结束扩增。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.7 RT-PCR方法的建立及特异性试验

以设计的TGEV-N1、N2为引物，在相同的反应条件下，对PEDV、TGEV、HP-PRRSV、CSFV、FMDV-O、FMDV-A、FMDV-亚I进行扩增。

1.8 RT-PCR方法的敏感性试验

以TGEV的RNA为模板，测定浓度后，按10倍递进稀释后作为模板进行RT-PCR，以检测其敏感性。

1.9 RT-PCR方法的重復性测定

以TGEV的组织病料和疫苗对照株的cDNA为模板，用建立的RT-PCR方法重复进行PCR反应，以检测其重复性。

1.10 RT-PCR方法的准确性

取TGEV的组织病料和疫苗对照株的cDNA作为模板，用建立的RT-PCR方法扩增，取PCR产物回收、纯化、连接pMD-18T载体后送宝生物工程（大连）有限公司测序，检测其准确性。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR方法的建立及特异性试验

以设计的TGEV-N1、N2为引物，在相同的反应条件下，对TGEV、TGEV、HP-PRRSV、CSFV、FMDV-O、FMDV-A、FMDV-亚I进行扩增。结果只有TGEV扩增出约388bp的特异片段，而其他病毒均未出现目的片段，表明该方法对TGEV病毒有较高的特异性（图1）。

2.2 RT-PCR方法检测TGEV的敏感性试验

以TGEV的RNA为模板，测定浓度后，按10倍递进稀释后作为模板进行RT-PCR，以检测其敏感性。结果显示，该RT-PCR反应最低能检出0.5 ng/μL的TGEV核酸模板量（图2）。

2.3 RT-PCR对样品检测的重复性试验

对TGEV组织病料阳性样品和疫苗对照毒株的cDNA进行10次重复PCR扩增反应，均能够扩增出约388 bp的目的条带，表明该方法的重复性良好。

2.4 RT-PCR方法的准确性

取TGEV的组织病料和疫苗对照株的cDNA作为模板，用建立的RT-PCR方法扩增，取PCR产物回收、纯化、连接pMD-18T载体后送宝生物工程（大连）有限公司测序，测得序列上传至NCBI网站进行BLAST，结果表明该方法扩增到的是TGEV N基因（图3）。

3 结论与讨论

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（P-EDV）和轮状病毒（PoRV）是引起腹泻的常见病原，且这3种病毒引起的腹泻在流行病学上、临床上和病理变化等方面极其相似，临床上很难区分。而病毒分离、免疫组化和电镜检测等诊断技术需要在试验条件良好的实验室才能操作完成。本研究参考GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的核苷酸序列设计1对TGEV-N1、TGEV-N2引物，建立RT-PCR检测方法，获得约388 bp目的片段。使用该方法对506份临床组织病料样品和对照病毒样品进行RT-PCR检测，结果表明利用该方法实现了快速诊断的目的。同时，特异性和敏感性试验及重复性、准确性试验也分别表明该方法的特异性、敏感性良好，重复性稳定，目的基因结果准确[4-6]。

应用本研究建立的RT-PCR方法检测采集到的506份疑似TGEV组织病料样品，结果表明，有184份呈阳性，阳性率达36.3%。2014年，“猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的检测RT-PCR法”（DB 45/T 1007—2014）作为地方标准由广西壮族自治区质量技术监督局发布实施，为今后开展猪传染性胃肠炎的流行病学调查和疫病防控工作提供了有力的技术支持。

4 参考文献

[1] 殷震，刘景华动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：681-688.

[2] 朱密.猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测方法研究进展[J].安徽农学通报，2016，22（12）：110-111.

[3] 焦洋.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪博卡病毒多重检测方法的建立[D].南京：南京农业大学，2013.

[4] 梁乔.猪流行性腹泻的实验室诊断技术[J].畜牧兽医科技信息，2016（4）：7.

[5] 兰喜.猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究[D].北京：中国农业科学院，2006.

[6] 王玉洁，刘金龙，彭树英，等.应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2005（2）：23-26.