表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定

张玲楷，李永锋，谢利豹，孙元，王晓，仇华吉

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069

猪瘟 (Classical swine fever，CSF) 是由猪瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV) 引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。临床上主要以高热稽留、广泛性出血和高死亡率为主要特征[1]。世界动物卫生组织 (OIE)将其列入 OIE疫病名录，为须申报的动物传染病。我国制定的《国家中长期动物疫病防治规划 (2012–2020年)》将其列为五种优先防治的“一类动物疫病”之一。尽管美国、加拿大和新西兰等部分发达国家消灭了该病，但它仍是世界和我国养猪业的重要威胁[2-3]。

CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，为黄病毒科瘟病毒属成员，基因组长约12.3 kb，含有一个开放阅读框 (ORF)，在宿主和病毒酶系统的作用下，形成4种结构蛋白 (C、Erns、E1和E2)和 8种非结构蛋白 (Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[4-5]。

猪圆环病毒病 (Porcine circovirus-associated disease，PCVAD) 是由猪圆环病毒 2型 (Porcine circovirus 2，PCV2) 引起的多种病症的总称。PCV2主要侵害免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致感染的猪只产生免疫抑制和继发感染其他病原微生物，从而使死亡率明显上升[6]。该病可导致仔猪断奶后多系统综合征、皮炎和肾病综合征、繁殖障碍、肠道疾病、仔猪先天性震颤和仔猪渗出性皮炎等疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。根据基因组序列不同，PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四个基因型，近几年出现的PCV2d已逐渐成为优势基因型[7-8]。

近年来，随着养猪规模的扩大，CSF的流行和发病特点以及表现形式也发生了很大变化，急性和典型性CSF病例在逐渐减少，多以非典型性、慢性及隐性 CSF形式出现[9]。研究发现，CSFV常与其他病毒性、细菌性或寄生虫性病原混合感染，其中尤其以 PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、伪狂犬病病毒 (PRV) 等病毒性疾病混合感染最常见[10]。猪群感染 PCV2、PRRSV和PRV后，不仅可直接危害猪只健康，还可侵害猪体的免疫系统，造成免疫抑制，降低猪体对CSFV等病原体的抵抗力和对疫苗的反应性。研究表明，PCV2、PRV、PRRSV单独或混合感染猪体后会影响CSF疫苗的免疫效果，导致CSFV在猪体内的长期存留，引起持续感染[11]。

猪瘟兔化弱毒疫苗株 (C株或 HCLV株) 是我国学者在20世纪50年代通过将CSFV强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的[12]。C株是一株非常安全有效的弱毒疫苗，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，对各种年龄的家猪和野猪均安全[12]；用C株接种后2–4 d，即能对不同基因型的CSFV株均提供有效保护[13-14]。因此，从安全性和免疫原性上看，C株具有作为活病毒载体的潜力和优势。

本研究中，我们在C株感染性克隆Npro蛋白的氨基酸13和14之间引入PCV2的主要保护性抗原Cap基因，获得能够稳定表达Cap蛋白的重组病毒，并评价该重组病毒在家兔体内的生物学特性和免疫原性，为研制猪瘟和猪圆环病毒病二价疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和病毒

C株的感染性克隆pCSFV-HCLV和包含Cap基因的质粒 pMD18T-Simple-VP2-2A-Cap由本实验室保存。SK6细胞用含5%胎牛血清的DMEM培养基 (不含牛病毒性腹泻病毒和牛病毒性腹泻病毒的抗体)培养，并放置于含5% CO2的37 ℃温箱中。C株 (HCLV株) 以及从感染性cDNA克隆拯救出的C株 (rHCLV) 均在SK6细胞中培养，猪圆环灭活疫苗LG株购自维科生物技术有限公司。

1.2 感染性克隆pHCLV-Cap的构建

我们以感染性克隆pCSFV-HCLV为骨架构建重组感染性克隆pHCLV-Cap (图1)。简言之，用表1中列出的引物通过重叠PCR将Cap基因插入到Npro蛋白第13位和第14位氨基酸之间。然后，将PCR产物通过分子克隆技术克隆至pCSFV-HCLV获得pHCLV-Cap，并用多种核酸限制性内切酶和序列测定对获得的pHCLV-Cap进行鉴定。

1.3 重组病毒rHCLV-Cap的拯救

我们用之前报道的方法[15]拯救重组 C株rHCLV-Cap。具体操作步骤如下：将6 µg pHCLV-Cap转染至SK6细胞，然后将细胞传代15次。通过3次反复冻融收获病毒。用CSFV抗原捕获试剂盒检测重组病毒 rHCLV-Cap第 1–15代 Erns蛋白的表达。通过 RT-PCR从拯救出的病毒上清中提取的病毒基因组中扩增Npro-Cap融合基因、E2、NS5B或者其他基因，并进行测序鉴定。

1.4 间接免疫荧光试验

将拯救的病毒rHCLV-Cap接种于生长至70%单层的 SK6细胞中，2 h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS) 洗2遍，然后加入新鲜的含2%胎牛血清的DMEM，在5% CO2、37 ℃环境中继续培养，48 h后弃上清，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗细胞2次，然后用-20 ℃预冷的无水乙醇固定细胞20 min，加入针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体HQ06或PCV2 Cap单克隆抗体3A5，37 ℃作用2 h后用PBS洗涤3次，加入1∶100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG (Sigma公司)，置于湿盒中37 ℃作用45 min，用PBS分别洗涤3次后，置于倒置荧光显微镜下观察。

图1 全长感染性克隆pHCLV-Cap的构建策略Fig.1 Strategy for the construction of pHCLV-Cap.

表1 构建pHCLV-Cap所用的引物Table 1 Primers used for construction of pHCLV-Cap

1.5 重组病毒的生长曲线测定

将rHCLV-Cap和C株分别以感染复数 (MOI)为0.1的剂量接种于铺有SK6细胞的24孔板中，37 ℃感染2 h后，弃去病毒液，更换新的培养液，再将细胞放在含5% CO2的37 ℃温箱中培养。每12 h反复冻融收获病毒，用Reed-Münch方法通过间接免疫荧光试验检测收获病毒的滴度[16]，并用TCID50/mL表示。实验重复3次，然后计算出平均值和标准偏差。

1.6 家兔接种试验

动物实验已经过中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物福利委员会的批准，其许可证为SYXK (黑龙江) 2011022。我们将27只14周龄新西兰白兔随机分为5组，每组6只 (除D组3只外)。A 组家兔通过耳缘静脉接种 104TCID50rHCLV-Cap， B组接种104TCID50rHCLV，C组接种104TCID50C株，D组皮下接种LG株，E组接种1 mL的DMEM。接种之后，每6 h记录家兔的直肠温度来监测它们的定型热反应，接种后第3天从A、B、C和E组中随机选取3只家兔进行安乐处死，采集家兔脾脏，用荧光定量RT-PCR检测家兔脾脏中病毒的RNA拷贝数；在接种后3 w，对D组的3只家兔及其他组剩余的3只家兔进行加强免疫，免疫剂量及途径同初次免疫。

充分利用废水再利用，不但有效节约用水，还可以变废水为可再利用资源，有效缓解资源匮乏和环境污染带来的压力，从社会效益和经济效益都适合大力推广。在循环水系统中，如今方案带来的经济效益较少还不能真实的展示出来，但是随着国家对水资源价格和污水排放愈加重视和投入，经济效益将会越来越显著。

整个试验过程中，每隔3天采集所有组家兔的血清，将采集到的家兔血清样本用CSFV抗体ELISA检测试剂盒 (IDEXX) 和 PCV2抗体ELISA检测试剂盒分别检测抗 E2抗体和抗 Cap抗体。

1.7 阻断ELISA

免疫前以及免疫后每3天采血，分离血清。用猪瘟抗体检测试剂盒 (IDEXX公司，批号C281) 和PCV2 Cap抗体检测试剂盒 (Synbiotics公司，批号 SCIRCO1N17) 检测抗体水平，具体操作方法见说明书。

1.8 定量PCR/RT-PCR

我们通过荧光定量 RT-PCR检测家兔脾脏中的病毒RNA水平[17]。具体方法如下：25 µL缓冲液的反应体系中包含3 µL cDNA，2.5 µL 10× ExTaq缓冲液，2 µL dNTPs (各含 2.5 mmol/L)，各 1 µL HCLV-F 和 HCLV-R (10 µmol/L)，0.5 µL HCLV-JOE(10 µmol/L) 探针和 2 U Hot Star EXTaqDNA 聚合酶。循环条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s和60 ℃退火/延伸45 s (40个循环)。每个样本的实验进行3次重复。通过标准曲线计算病毒基因组的RNA拷贝数。

1.9 统计学分析

应用 SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，P≥0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 重组病毒rHCLV-Cap的获得

将重组感染性克隆 pHCLV-Cap转染SK6细胞拯救重组病毒 rHCLV-Cap，用 IDEXX猪瘟病毒抗原检测ELISA试剂盒对第1–15代的SK6细胞上清检测，结果显示，所拯救的第10–15代的重组病毒的Erns蛋白抗原为阳性 (图2)。

图2 重组病毒rHCLV-Cap抗原捕获ELISA的检测Fig.2 Detection of the recombinant virus rHCLV-Cap by antigen-capture ELISA.

按照病毒 RNA提取说明书提取病毒基因组RNA后，通过RT-PCR扩增并测序目的基因，结果表明重组病毒基因组 RNA包含Npro-Cap基因并与预期大小一致 (约1.2 kb)，测序结果显示，Npro-Cap基因不存在任何突变。以上结果表明，我们获得了包含Cap基因的重组病毒rHCLV-Cap。

2.2 外源蛋白在重组病毒rHCLV-Cap中的表达

为了鉴定获得的重组病毒rHCLV-Cap中Cap蛋白的表达，将rHCLV-Cap感染SK6细胞48 h后，通过间接免疫荧光检测Cap蛋白，结果显示，用鼠源抗Cap单抗检测到感染重组病毒rHCLV-Cap的细胞产生特异性荧光 (图 3)。结果表明，重组病毒rHCLV-Cap能够表达外源Cap蛋白。

2.3 重组病毒的生长动力学和遗传稳定性

我们评估了rHCLV-Cap的体外生长特性。重组病毒rHCLV-Cap与亲本病毒，有着相似的生长能力 (图4)，这表明Cap基因的插入不影响重组病毒的生长能力。

图3 间接免疫荧光试验检测 Cap蛋白在重组病毒rHCLV-Cap中的表达Fig.3 The expression of the Cap protein in the recombinant virus rHCLV-Cap examined by IFA.

图4 重组病毒rHCLV-Cap的生长曲线Fig.4 Growth property of the recombinant virus rHCLV-Cap in SK6 cells.

为了评价插入的Cap基因在病毒基因组中的遗传稳定性，我们将拯救成功的 rHCLV-Cap在SK6细胞上连续传20代。将第15–20代rHCLV-Cap的Npro-Cap基因通过RT-PCR扩增并测序。结果表明，所有子代病毒中均可扩增到预期大小约1.2 kb的目的基因 (图 5)。另外，测序结果显示，Cap基因在各代rHCLV-Cap的基因组中均保持完整和正确性。

2.4 重组病毒在家兔体内的生物学特性和免疫原性

为了检验rHCLV-Cap在家兔体内的生物学特性和免疫原性，不同组的家兔接种指定的病毒，在接种后的不同时间点检测接种家兔的体温和血清中的抗体水平。接种C株或rHCLV的家兔都在接种后24 h或36 h出现发热，持续18–24 h，并且重组病毒rHCLV-Cap同样能保持引起定型热反应的生物学特性。值得注意的是，免疫重组病毒的家兔在免疫后10 d可以产生抗E2抗体 (表2)，并持续升高 (图 6)。这些数据表明，rHCLV-Cap在家兔体内具有与C株一致的生物学特性和免疫原性。然而接种重组病毒在家兔体内不能较好地诱导产生抗Cap抗体 (图7)。

图5 RT-PCR检测Cap基因在重组病毒rHCLV-Cap中的遗传稳定性Fig.5 The stability of the Cap gene in the recombinant virus rHCLV-Cap tested by RT-PCR.

表2 重组病毒接种后家兔的定型热反应和脾脏中复制情况Table 2 Fever response and viral replication of the rabbits inoculated with the recombinant virus

图6 重组病毒免疫家兔后的抗E2特异性抗体Fig.6 Anti-E2 antibodies of the rabbits immunized the recombinant virus rHCLV-Cap.

3 讨论

图7 重组病毒免疫家兔后的抗Cap特异性抗体Fig.7 Anti-Cap antibodies of the rabbits immunized the recombinant virus rHCLV-Cap.

在本研究中，我们以PCV2Cap基因作为模式基因来评价 C株作为活病毒载体的潜力。Cap蛋白是 PCV2的主要结构蛋白和免疫保护性抗原，能刺激动物机体产生针对 PCV2的特异性免疫应答。国内外研制的针对Cap蛋白的亚单位疫苗对不同基因型的 PCV2感染具有良好的免疫保护力[18]。目前的研究表明，CSFV中仅 Npro蛋白和 C蛋白可以允许外源基因的插入，而且在Npro蛋白中插入外源基因对 CSFV生长特性影响较小[19-20]。本研究中将Cap基因插入Npro蛋白中并成功拯救出一株能够稳定表达Cap基因且保持亲本病毒生长特性的重组病毒。

将C株和rHCLV-Cap通过耳缘静脉接种家兔来评价其免疫原性，接种的家兔表现出定型热反应。在本实验室之前的研究中，C株的3′-非编码区 (UTR) 被CSFV石门株的UTR替换后不会诱导产生定型热反应，但是会保持其免疫原性[21]。在本研究中，Cap基因的插入不仅没有改变C株在家兔体内的致病性，而且也未影响C株的免疫原性。值得注意的是，重组病毒能够诱导家兔产生针对CSFV E2的特异性抗体。

然而，重组病毒并不能诱导家兔产生较稳定的抗Cap抗体。我们分析其主要的原因有两种，其一是重组病毒表达的 Cap蛋白定位在细胞核内。这与之前的Cap蛋白的亚定位研究结果保持一致，是由于Cap蛋白N端有一段41个氨基酸残基组成的核定位信号[22]。其二是重组病毒的滴度只有104TCID50，重组病毒的滴度不能够表达足够量的Cap蛋白。前人研究发现CSFV感染细胞主要是通过Erns和E2蛋白与细胞表面蛋白的相互作用[23]。研究证实硫酸乙酰肝素是病毒蛋白Erns吸附宿主细胞的一个受体，Erns蛋白第476位丝氨酸突变为精氨酸能够增强病毒对宿主细胞的吸附能力[24]；E2蛋白上第37位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，能够增强病毒拮抗细胞抗病毒应答的能力[25]。因此，在后续研究中我们需去除 Cap蛋白核定位信号并提高病毒滴度来优化重组病毒，并在家兔和猪只上进行免疫效力评价。

总之，本研究以C株为活病毒载体构建表达PCV2 Cap蛋白的重组病毒rHCLV-Cap，此重组病毒在家兔体内保持与C株一致的生物学特性，并且能够诱导家兔产生针对CSFV E2的抗体。然而不能诱导家兔产生针对Cap的抗体。今后我们将通过提高重组病毒的病毒滴度和表达分泌型Cap蛋白的形式优化重组病毒。

[1]Moennig V.Introduction to classical swine fever:virus, disease and control policy.Vet Microbiol,2000, 73(2/3): 93-102.

[2]Edwards S, Fukusho A, Lefèvre PC, et al.Classical swine fever: the global situation.Vet Microbiol,2000, 73(2/3): 103-119.

[3]Vandeputte J, Chappuis G.Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas.Rev Sci Tech, 1999, 18(3): 638-647.

[4]Heimann M, Sosa GR, Martoglio B, et al.Core protein of pestiviruses is processed at the C terminus by signal peptide peptidase.J Virol, 2006, 80(4):1915-1921.

[5]Gottipati K, Ruggli N, Gerber M, et al.The structure of classical swine fever virus Npro: a novel cysteine autoprotease and zinc-binding protein involved in subversion of type I interferon induction.PLoS Pathog, 2013, 9(10): e1003704.

[6]Ellis J, Hassard L, Clark E, et al.Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome.Can Vet J, 1998,39(1): 44-51.

[7]Zou WB, Qi DM.Research progress of genetic variation and evolution of porcine circovirus type 2.Guangdong J Animal Vet Sci, 2017, 42(3): 4-7 (in Chinese).邹伟斌, 齐冬梅.猪圆环病毒2型的遗传变异和进化研究进展.广东畜牧兽医科技, 2017, 42(3): 4-7.

[8]Jiang CG, Wang G, Tu YB, et al.Genetic analysis of porcine circovirus type 2 in China.Arch Virol, 2017,162(9): 2715-2726.

[9]Ning YB, Wu WF.New epidemic characteristics of classical swine fever in China and the research of vaccine and immunization.Chin J Vet Drug, 2011,45(8): 33-37 (in Chinese).宁宜宝, 吴文福.我国猪瘟流行新特点与疫苗免疫研究.中国兽药杂志, 2011, 45(8): 33-37.

[10]Ge XN, Wang F, Guo X, et al.Porcine circovirus type 2 and its associated diseases in China.Virus Res, 2012, 164(1/2): 100-106.

[11]Huang YL, Pang VF, Lin CM, et al.Porcine circovirus type 2 (PCV2) infection decreases the efficacy of an attenuated classical swine fever virus(CSFV) vaccine.Vet Res, 2011, 42: 115.

[12]Qiu HJ, Tong GZ, Shen RX.The lapinized Chinese strain of classical swine fever virus: a retrospective review spanning half a century.Sci Agric Sin, 2005,38(8): 1675-1685 (in Chinese).仇华吉, 童光志, 沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾.中国农业科学, 2005, 38(8):1675-1685.

[13]Ferrari M.A tissue culture vaccine with lapinized Chinese (LC) strain of hog cholera virus (HCV).Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 1992, 15(3):221-228.

[14]Kaden V, Renner C, Rothe A, et al.Evaluation of the oral immunisation of wild boar against classical swine fever in Baden-Wurttemberg.Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2003, 116(9/10): 362-367.

[15]Li C, Huang JH, Li YF, et al.Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system.Arch Virol, 2013, 158(4): 901-907.

[16]Reed LJ, Münch H.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg, 1938, 27:493-497.

[17]Zhang XJ, Han QY, Sun Y, et al.Development of a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-type and HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea virus 1.Res Vet Sci, 2012, 92(3): 512-518.

[18]Beach NM, Meng XJ.Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus type 2 (PCV2).Virus Res,2012, 164(1/2): 33-42.

[19]Moser C, Tratschin JD, Hofmann MA.A recombinant classical swine fever virus stably expresses a marker gene.J Virol, 1998, 72(6):5318-5322.

[20]Riedel C, Lamp B, Heimann M, et al.Characterization of essential domains and plasticity of the classical swine fever virus core protein.J Virol, 2010, 84(21): 11523-11531.

[21]Li C, Li YF, Shen L, et al.The role of noncoding regions of classical swine fever virus C-strain in its adaptation to the rabbit.Virus Res, 2014, 183:117-122.

[22]Liu Q, Tikoo SK, Babiuk LA.Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2.Virology, 2001, 285(1): 91-99.

[23]Wang Z, Nie YC, Wang PG, et al.Characterization of classical swine fever virus entry by using pseudotyped viruses: E1 and E2 are sufficient to mediate viral entry.Virology, 2004, 330(1):332-341.

[24]Hulst MM, van Gennip HGP, Moormann RJM.Passage of classical swine fever virus in cultured swine kidney cells selects virus variants that bind to heparan sulfate due to a single amino acid change in envelope protein Erns.J Virol, 2000, 74(20):9553-9561.

[25]Li S, Wang JH, He WR, et al.Thioredoxin 2 is a novel E2-interacting protein that inhibits the replication of classical swine fever virus.J Virol,2015, 89(16): 8510-8524.