耳聋基因芯片对耳聋高危人群检测的临床意义

陈俞　范宇琴

[摘要]目的分析耳聋高危人群检测中耳聋基因芯片的临床应用价值。方法方便选择该院2015年8月-2016年12月接收的耳聋患者120例，均应用耳聋基因芯片实施突变检测，观察检测结果。结果120例患者中，63例检出基因突变，检出率39.1%；63例检出基因突变患者中，重度耳聋38例，极重度耳聋25例；57例未检出基因突变患者中，重度耳聋50例，极重度耳聋7例。结论耳聋高危人群检测中，耳聋基因芯片的应用可提升检出率，降低耳聋发生率。

[关键词]耳聋基因芯片；耳聋高危人群；检测；临床意义

[中图分类号]R764 [文献标识码]A [文章编号]1674-0742（2017）10（a）-0055-03

耳聋在临床中比较常见，发病后不仅交流受到影响，而且生活質量会严重降低。在耳聋患者中，0.1%～0.3%为新生儿。从致病原因看，由遗传因素导致的耳聋患者占据总数的50%以上。因耳聋存在高度的基因及位点遗传异质性，且相关于多个基因的突变，因而如采取传统检测4方法，仅能将同一基因同一位点检测出来，达不到筛查诊断要求。研究指出，耳聋高危人群检测中，耳聋基因芯片技术具有较高的应用价值，可与筛查诊断要求相符合。因此，该院以2015年8月-2016年12月接收的汉族耳聋患者120例为研究对象，探讨耳聋基因芯片的应用价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

方便选择新疆医科大学第一附属医院接收的汉族耳聋患者120例，男68例，女52例；年龄3个月～59岁，平均（32.7±6.4）岁。纳入标准：均符合耳聋诊断标准，患者及（或）家属均对该研究知情，且自愿参与研究。

1.2方法

研究人员调查记录患者发病年龄、家族史、疾病史等；所有患者均接受耳聋基因芯片（北京博奥生物有限公司）检测，检测步骤如下。

1.2.1标本采集与处理于患者肘静脉处采集血液标本5mL，置入采血管（EDTANa2抗凝）中，全血基因组DNA提取时，利用全血核酸提取试剂盒（天根生化公司），完成后在20℃冰箱中保存。

1.2.2PCR反应引物共8组，针对8个突变位点[GJB2基因（突变位点：35delG、176dell6/235delc、299-300de1AT），SLC26A4基因（突变位点：2168A>G、IVS7-2A>G），线粒体12rRNA基因（突变位点：1494C>T、1555A>G）]，将其分为两个反应体系，分别标记为A、B，实施多重PCR，A、B反应体系各20μL，将100～200ng/μL浓度的待测全血基因组DNA加入其中，扩增引物混合物12.5μL，扩增试剂混合物4.5μL。PCR反应时，程序如下：37℃下，反应10min；温度提高至95℃，反应15min；温度再提高至96℃，进行1min预变性；之后温度降低至94℃，反应30s；继续降低至55℃，反应30s；提高到72℃，反应45s，循环共进行32个；降低至70℃，反应45s，最终降低至60℃，反应10min。反应期间，温度由94℃降低至55℃时，降低速度控制在0.4℃/s，而由55℃提高至70℃时，提升速度控制在0.2℃/s。

1.2.3杂交 95℃条件下，于金属浴中放置PCR产物，给予10min变性，完成后，迅速向冰水中放置PCR产物，冰浴3min。从A、B反应体系管中将相同标本取出，量均为25μL，向试管（内置杂交缓冲液10μL）中混入，混合均匀会，于芯片微阵列区域中加入，用盖玻片封闭杂交盒后，在预热杂交箱（50℃）中放置，进行1h保温。

1.2.4洗片 完成杂交后，取出芯片，在洗涤液I（42℃）中放置，之后通过摇床，进行2min洗涤，随后取出，并于洗涤液Ⅱ（42℃）中快速放人，再经摇床给予2min洗涤。结束后，在玻片架上放置芯片，利用离心机甩干液体，离心速度1200r/min，时间2min。

1.2.5芯片扫描 芯片扫描利用扫描仪进行，扫描仪采用晶芯LuxScanTM 10K/B微阵列芯片.激光扫描强度设置为90，激光波长选择532nm。

1.3观察指标

观察所有患者检测结果，同位点中，探针W信号表现为阳性时，位点属于野生型；探针M信号表现为阳性时，位点属于纯合突变型；探针W信号与探针M信号均表现为阳性时，位点属于杂合突变型。

2结果

120名患者中，63例检出基因突变，检出率39.1%，其中，48例GJB2基因突变携带者，15例SLC26A4基因突变携带者。48例GJB2基因突变携带者中，235delc纯合突变28例，235delC杂合突变16例，235delC/299-300delAT复合突变4例；15例SLC26A4基因突变携带者中，IVS7-2A>G纯合突变8例，IVS7-2A>G杂合突变7例。28例235delC纯合突变患者中，23例患者父母均抽血检测，3例患者仅有母亲抽血检测，2例患者父母均未抽血检测，结果显示：23例患者父母中，均为235delC杂合突变；3例患者母亲均为235delc杂合突变。16例235delC杂合突变患者中，10例患者父母中，一方为235delC杂合突变，另一方为野生型；3例患者父母中，一方为235delC杂合突变，一方为235delC纯合突变；3例患者母亲检测显示为235delC杂合突变，父亲未接受检测。4例235delC/299-300delAT复合突变患者中，父母均接受检测，结果显示，235delC杂合突变出现在父亲，299-300delAT杂合突变出现在母亲。8例IVS7-2A>G纯合突变患者中，均为亲属关系，父母检测结果显示，均携带IVS7-2A>G杂合突变。7例IVS7-2A>G杂合突变患者中，父母检测结果显示，一方携带IVS7-2A>G杂合突变，一方表现为野生型。听力检测结果显示：63例检出基因突变患者中，重度耳聋38例，极重度耳聋25例；57例未检出基因突变患者中，重度耳聋50例，极重度耳聋7例。

3讨论

耳聋是一种最常见的疾病，依据具体的表型特点，耳聋可分为两种，一种为综合征性耳聋（SHL），另一种为非综合征性耳聋（NSHL）；根据遗传方式，耳聋可分为五种，分别为常染色体显性遗传（AD）耳聋、常染色体隐性遗传（AR）耳聋、X连锁遗传耳聋、Y连锁遗传耳聋、线粒体遗传耳聋，其中最为多见的即为AR耳聋。随着不断的实施与完成人类基因组计划，耳聋遗传学研究取得的进步是非常大的，可定位克隆多数的耳聋相关基因，由此也称产生耳聋基因诊断。

对于遗传性耳聋，患者种族不同时，会具有不同的致病基因，即使基因相同，突变位点也存在差异，甚至同一种族中，致病基因或同一基因突变位点也存在地区差异，种族特异性非常强。在我国，占据五项残疾首位的即为听力语言残疾。据耳聋病分子流行病学调查结果，耳聋患者中，GJB2基因突变携带者约占据38%，SLC26A4基因突变携带者约占据14.5%，线粒体DNAA1555G突变携带者约占据3.8%，线粒体DNA C1494T突变携带者约占据0.6%E3J。该研究中，GJB2基因突变携带者占总患者40.0%、SLC26A4基因突变携带者占总患者12.5%，与上述调查结果基本一致。由上述调查结果可知，我国耳聋患者常见的致病基因为GJB2、SLC26A4及线粒体，前两个基因属于AR，第3个基因属于母系遗传。此外，SLC26A4基因突变也为耳聋患者中比较常见的突变情况，应用耳聋基因芯片后，同样可以一次性检出。该研究中选取的161例耳聋患者中，利用耳聋基因芯片检测中基因突变携带者63例，其中48例为GJB2基因突变携带者，15例为SLC26A4基因突变携带者，与流行学调查将结果存在一定的差异，考虑与样本量数量少、地区不同等因素相关，还需要做出进一步的深入研究。

我国每年约有400万人的药物敏感性突变携带者，35万人左右的药物性耳聋患者，线粒体DAN 12Sr-RNA为与其对应的基因，可母系遗传，即携带者如为母音，怀孕后生育的子女会耳聋，而父亲携带时，则生育的子女不会耳聋。GJB2基因属于AR，先天性重度以上感音神经性耳聋为相关症状，患者同胞中，发病25%，通常隔代遗传，可发生于男性，也可发生于女性，治疗时采用人工耳蜗具有较好的效果。聋哑人因具有特殊的自身情况，配偶为正常人的几率比较小，再加上聋哑人与聋哑人之间使用相同的语言沟通，存在基本相同的文化背景，因此婚配形式多为“聋一聋”方式，此种方式会极大的增加擁有相同基因突变位点的可能，从而提高后代耳聋的发生风险。因此，对于先天或后天耳聋患者，或新生儿未通过听力筛查，或家属携带耳聋基因时，均属于高危人群，耳聋基因芯片检查应尽早的开展，并根据检测结果给予适当的干预，促进致残率的降低，提高患者的生活质量，并提升我国的人口素质水平。

综上所述，耳聋高危患者筛查与诊断中，耳聋基因芯片检测具有十分重要的应用价值，能够更为准确、快速的检测出患者的基因突变情况，假阳性率低，且操作简单，适合推广于临床当中，降低耳聋发生率，尤其适合产前诊断中，减少新生儿耳聋的发生，提高人口出生素质。

（收稿日期：2017-07-04）