通过外周血诊断肝细胞癌的研究进展

周游，季菊玲

(1南通大学医学院，江苏南通226001；2海门市人民医院)

肝细胞癌(HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤。HCC常发生于炎症和慢性损伤的肝脏，不易早期发现。超声检查易受操作者经验的影响，CT和MRI检查也仅在结节直径大于1 cm时有效，且难以鉴别早期HCC和肝硬化不典型增生结节。结节较小时，肿瘤活检的难度增加，对组织学诊断也是一大挑战。通过外周血检测HCC具有操作简便、非侵入性和可重复性等优点。近年来采用基因组学、蛋白质组学等新技术手段对HCC原发肿瘤、循环非编码核酸、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等开展了大量研究，拓展了通过外周血检测HCC的方法和途径。现将该领域的研究进展综述如下。

1 血清蛋白标志物

1.1 甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白异质体3(AFP-L3) AFP是目前临床应用最广泛的HCC标志物。AFP临床检测多用化学发光法，主要用于HCC高危人群的筛查和诊断、HCC进展监测及预后判断、对治疗反应的观察。AFP基因在胎儿期于卵黄囊肝细胞和内胚层细胞中表达，出生后表达下降。AFP的主要功能是在胎儿期调控脂肪酸代谢和成年后促进肝细胞增生。由于细胞增生和再生加速，活动性肝炎患者可出现血清AFP水平升高。正常AFP水平上限为20 ng/mL，慢性肝炎患者可轻微超过20 ng/mL，但不能诊断为HCC，采用20 ng/mL作为临界值将导致特异性降低。临床上AFP水平超过400 ng/mL时能明确诊断HCC，但这个值缺乏灵敏度。近年研究发现，AFP联合Gd-EOB-DTPA增强MRI(EOB-MRI)可以用来判断HCC患者预后。正钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)摄取与血清AFP低水平和HCC患者预后良好有关，而血清AFP水平升高、Gd-EOB-DTPA摄取降低的HCC患者与致癌基因FOXM1的激活和预后不良相关[1]。

AFP-L3是AFP的异质体。AFP的异质性与糖链的岩藻糖基化有关，HCC细胞产生的AFP糖链和肝硬化患者体内发现的AFP糖链对凝集素的亲和力不同。AFP-L3由HCC细胞产生，对HCC的诊断更特异。因此AFP-L3可能是区分HCC和慢性肝病的有用标志物。小HCC(直径<3 cm)患者中约35%能检测到AFP-L3。高水平AFP-L3存在于体积大、多结节、低分化的晚期HCC，AFP-L3阳性提示HCC预后较差。

1.2 脱-γ-羧基凝血酶原(DCP) 维生素K是凝血因子γ-羧化酶的辅酶，维生素K缺乏导致肝脏凝血酶原合成异常，形成DCP，DCP可反映肝细胞功能异常[2]。癌变肝细胞中也可出现维生素K依赖性凝血因子羧化不足，从而生成大量DCP。以DCP 40 mAU/mL作为HCC诊断的临界值，可提高小HCC的早期检出率。然而DCP诊断的灵敏度和特异性受到肿瘤体积的影响，DCP诊断的准确性在长期阻塞性黄疸、肝内胆汁淤积以及摄入华法林时下降。Toyoda等[3]研究发现，血清DCP水平与HCC进展、肝功能和肝纤维化程度密切相关，DCP有助于HCC的诊断和预后评估。

1.3 磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(GPC3) GPC3是一种癌胚抗原，其编码一种硫酸类肝素蛋白多糖，通过糖基磷脂酰基醇固定在细胞表面，与生长因子相互作用，并调节其功能。研究表明，GPC3在成人正常组织中不表达或低表达，在HCC高表达，是一个非常有潜力的HCC诊断标志物。40%～53%的HCC患者可检测出GPC3，其中33%的HCC患者AFP和DCP均正常。可溶性GPC3在诊断高中分化HCC时的灵敏度高于AFP，可溶性GPC3与AFP联用能将诊断灵敏度从50%提高到72%[4]。Feng等[5]研究发现，GPC3能预测肿瘤复发。GPC3通过刺激致癌信号传导途径促进HCC生长，在HCC中过表达，但在正常成人肝组织中不表达或低表达，因此是理想的HCC治疗靶点。目前针对GPC3的HCC靶向治疗抗体人MDX-1414、HN3和人源化小鼠GC33、YP7已处于临床前评估或Ⅱ期临床试验阶段。

1.4 骨桥蛋白(OPN) OPN是一种分泌型磷酸化糖蛋白。免疫细胞、上皮组织、平滑肌细胞、成骨细胞和肿瘤细胞均可产生OPN，正常肝脏组织表达很少，病理状态下主要表达于活化的肝脏巨噬细胞和星状细胞。有学者通过质谱分析血浆蛋白时发现，与肝硬化对照组相比，HCC患者中OPN显著上调。Ye等[6]在原发和转移性HCC的基因表达谱研究中发现，转移性肿瘤中OPN中或高度上调。一项前瞻性研究提示，在HCC诊断确立前1年就可出现血清OPN升高。OPN在HCC诊断方面比AFP灵敏度更高，且可识别AFP阴性的HCC。另有研究显示，人HCC组织中OPN与EGFR的表达呈正相关；敲减OPN可抑制EGFR介导的抗凋亡信号传导，从而降低化学诱导HCC的发生率；认为OPN具有促进HCC发生的作用。

1.5 肝细胞生长因子(HGF) HGF是含728个氨基酸的肝素结合糖蛋白，是促进肝细胞再生的重要介质。在一项募集了99例患者的HCV相关肝脏疾病的研究中发现，携带HCV的HCC患者血清HGF水平高于非携带者。在不考虑AFP或DCP水平的情况下，血清HGF高于0.6 ng/mL可诊断HCC。HCC通过旁分泌系统，包括细胞受体c-met参与HCC形成。c-met表达在侵袭性HCC中升高，与大体类型、血管侵犯、肝内转移和组织学类型有关，也与总体生存率降低有关。慢性肝病患者血清中也可检测到HGF。肝硬化患者HGF血清水平增加是HCC形成的标志。HGF血清水平≥1.0 ng/mL与低生存率相关，术前高HGF水平与肝功能衰竭等术后并发症的发生有关。术前血清HGF可评估肝功能并预测患者的预后，术后HGF血清水平升高能预示肿瘤的早期复发和转移。

1.6 胰岛素样生长因子1(IGF-1) 血液中的IGF-1主要由肝细胞合成和分泌，是重要的促生长因子，可调控多种细胞从G1期进入S期，内分泌和旁分泌产生的IGF-1在促进肿瘤生长过程中也起重要作用。Lippolis等[7]报道，IGF-1能拮抗瑞格菲尼对HCC细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用，以及药物介导的凋亡，影响抗癌药物的作用。Sprinzl等[8]报道，索拉非尼能调节巨噬细胞极化，在体外实验中抑制IGF-1驱动的癌细胞生长，可能有助于索拉非尼的抗癌活性。

1.7 血管内皮生长因子(VEGF) VEGF由血管内皮细胞分泌，是一个关键的血管生成刺激因子。肿瘤组织中，瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肥大细胞也能分泌高水平的VEGF，多种癌症中VEGF高表达与疾病进展和预后密切相关。研究表明，HCC患者VEGF的表达水平高于肝炎和肝硬化患者，可用于预测HCC转移和复发、判断HCC疗效及预后。血液VEGF高表达与HCC肝内转移、微静脉侵犯等显著相关。Rohr-Udilova等[9]发现，VEGF有利于早期HCC的血管形成和生长，抑制酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼的治疗和预防作用。针对VEGF受体的靶向治疗药物索拉菲尼也已应用于中晚期HCC。

1.8 鳞状细胞癌抗原(SCCA)和鳞状细胞癌抗原IgM免疫复合物(SCCA-IgM IC) SCCA属于丝氨酸蛋白酶抑制剂中的高分子量家族，对宫颈癌有较高的诊断价值，也用于肺鳞癌、食管鳞癌及其他鳞癌的辅助诊断和监测，是最早用于鳞癌诊断的肿瘤标志物。正常肝脏组织中不表达SCCA，HCC组织中SCCA异常升高，可能因为肝细胞和鳞状上皮细胞具有相同的胚胎来源。SCCA还具有保护肿瘤细胞免于凋亡、促进肿瘤生长的作用。SCCA异常表达是HCC形成中的一个早期事件，HCC患者血清SCCA水平高于肝硬化患者，在肝硬化发展为HCC的患者中能检测到血清SCCA-IgM IC升高。SCCA-IgM IC血清水平与HCC患者肝切除标本中SCCA的表达呈正相关。

1.9 α-L-岩藻糖苷酶(AFU) AFU是一种溶酶体酶，与含岩藻糖的糖复合物降解有关。AFU活性在HCC患者高于健康人群、慢性肝病和肝硬化患者。血清AFU达到700 nmol/(mL·h)时，约82%的肝硬化患者会发展为HCC。在HCC患者中，AFU水平与肿瘤体积呈正相关，与AFP水平或丙氨酸转氨酶活性无关。Wang等[10]实验发现，术前AFU是总生存期(OS)的独立预后因素，与AFU≤35 U/L的患者相比，术前AFU>35 U/L的患者无复发生存率和OS率较低，且较易形成大血管浸润。AFU已广泛应用于临床，对AFP阴性病例及小HCC的诊断价值极大。

1.10 嗜铬粒蛋白(CgA) CgA是一种存在于神经内分泌颗粒中的酸性糖蛋白。HCC患者血清CgA水平升高，是早期发现HCC的有用指标，较高的CgA血清水平也提示患者预后较差。但CgA水平在HCC患者和肝硬化患者中都升高，诊断特异性低。此外，CgA水平可能与HCC的神经内分泌分化程度有关[11]。

2 血清非蛋白编码核酸分子

2.1 微小RNA(miRNA) miRNA是高度保守的内源性非编码RNA，参与基因表达的转录后调控。约3%的人类基因组编码miRNA序列，其广泛参与机体的生理和病理过程[12]。定位于基因组脆弱位点的miRNA多与癌症有关，具有调节肿瘤细胞增殖、凋亡、转移和侵袭的作用。由于正常肝细胞和HCC细胞以及不同HCC分型间miRNA的表达存在差异，这些差异的miRNA有可能成为HCC检测和预后判断的标志物[13]。

有学者报道，血清miR-122水平较高的HCC患者生存期更长，但血清miR-122水平不是影响患者生存的独立因素。对正常肝脏、肝炎和HCC样本的miRNA基因组进行比较，结果显示HCC中miR-199a/b-3p下调，且与预后不良有关。miR-199a/b-3p参与调控PAK4/Raf/MEK/ERK通路，从而抑制HCC生长。通过腺病毒将miR-199a/b-3p拟似物递送至小鼠HCC移植瘤，可抑制肿瘤生长，提示miR-199a/b-3p可作为HCC治疗的潜在靶标。

Zhou等[14]通过检测乙肝相关HCC患者外周血miRNA，发现7种miRNA(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a、miR-801)组合能显著提高HCC的诊断准确性；不论疾病处于何种阶段，都能保持稳定的诊断准确率，且能区分HCC患者与健康人、慢性乙型肝炎患者与肝硬化患者，也可用于筛查AFP阴性的HCC患者。以上发现已于2018年转化为HCC诊断试剂盒，即将投入临床应用。

2.2 长链非编码RNA(lncRNA) lncRNA是长度超过200 nt、保守性较低的内源性RNA分子，能通过染色体修饰、转录和转录后加工等途径调控基因表达。lncRNA具有信号、诱饵、指导、支架四种功能，参与基因表达和细胞周期的调控，与许多疾病相关。近年来，lncRNA在HCC中的作用也受到关注。长度大约为1.6 kb核苷酸的HULC在HCC中显著上调，可通过细胞外信号调节激酶途径促进YB-1的磷酸化，调节YB-1与某些致癌基因的相互作用，加速这些致癌基因mRNA在肿瘤发生过程中的翻译[15]。Jiang等[16]发现，lnc-EGFR通过促进Treg细胞分化诱导免疫抑制，促进HCC。Yang等[17]报道了来自60个样品的匹配阵列数据，显示拷贝数变异和DNA甲基化的改变有助于观察到235个lncRNA的反复失调，提供了与HCC肿瘤发生和转移相关的功能性lncRNA和生物标志物的宝贵资源。

3 外周血肿瘤细胞及其产物

病理组织学检查是肿瘤诊断的金标准。然而组织学活检是侵入性的，而且单次活检的信息有限，因此很难通过连续活检监测肿瘤进展。体液活检是通过提取外周血中的肿瘤细胞或其产物，收集来自肿瘤的分子信息，样本来源更容易，可以根据需要反复取样，便于跟踪随访。体液活检目前主要包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA以及血清外泌体检测。

3.1 循环肿瘤细胞(CTC) 大多数恶性肿瘤患者死于肿瘤细胞在远隔器官的传播和种植。传统上认为转移仅发生在病程晚期，实际上每克肿瘤组织每天约释放100万个细胞到血液中，仅有很少一部分能形成远处转移并继续发展。最近基于乳腺癌实验模型的研究发现，与单个CTC相比，CTC群的转移潜能增加约50倍，与成熟癌细胞相比，CTC或许更能促进肿瘤进展[18]。

基于细胞体积、物理性质或特异细胞标志物捕获CTC的技术也在不断发展完善。FDA已批准第一个依赖一系列表面标记(CD45-、EpCAM+、CK8+、CK18+)捕捉和检测CTC的方案。靶向EpCAM的抗体包被磁珠是目前使用最广泛的CTC检测技术。大多数HCC相关的研究采用基于EpCAM的方法来评估CTC，然而只有30%的HCC细胞表达EpCAM。在一项根据EpCAM mRNA+ CTC区分HCC患者和对照的研究中，EpCAM mRNA+ CTC的灵敏度为42.6%，特异性为96.7%；当EpCAM mRNA+ CTC和AFP联合使用时，灵敏度提高至73.0%，特异性为93.4%。为实现异质性HCC CTC的有效分离、可靠检测和亚型分析，Chen等[19]提出了基于抗CD45抗体修饰的磁性纳米球的细胞分类方法，该方法能够分离更多的异质性HCC细胞，并能分析同一个临床HCC血液样品的3种不同CTC亚型，有助于HCC的预后判断或个性化治疗。

CTC检出率还受到肿瘤分期影响。一项研究评估了44例HCC患者的CTC，发现CTC或微栓子数量与肿瘤侵犯、门静脉血栓及存活率显著相关。对82例接受肝切除术HCC患者的研究发现，循环CTC数量与肝内、肝外复发有关，可独立预测存活率。

3.2 循环肿瘤DNA(ctDNA) ctDNA可通过被动和主动的机制被释放进入血液。对于正常组织，循环DNA可能主要通过细胞凋亡或坏死被动释放。血浆DNA片段的不同长度能表明它们是来源于凋亡(较短，<150 bp)或是坏死细胞(较长，>150 bp)。健康个体的白细胞能清除凋亡和坏死细胞碎片，因此循环DNA保持在低水平。炎症或恶性肿瘤时清除系统受损，血浆DNA水平增加。肿瘤细胞还有可能主动分泌释放DNA片段，CTC也可成为ctDNA的来源。

ctDNA可用于拷贝数变异、甲基化改变、单核苷酸变异等特异性结构改变的分析。由于肿瘤存在异质性和亚克隆，检测ctDNA与原发肿瘤所获得的突变率也存在差异。一项纳入106例结直肠癌患者的研究发现，通过ctDNA检测BRAF突变的灵敏度和特异度高达100%，检测KRAS突变的灵敏度和特异度分别为92%和98%[20]。学者们也对CTC和ctDNA用于肿瘤诊断的效果进行了比较。在一项纳入30例转移性乳腺癌患者的研究中，ctDNA存在于97%的患者，而CTC的检出率为87%[21]。一项采用ctDNA全基因组测序的跟踪研究中纳入了包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌的6例患者，采用不同抗癌方案治疗，研究描绘了6例患者的突变率随着时间的变化，显示了ctDNA在全程监控肿瘤演进中的作用[22]。

ctDNA作为HCC标志物的数据仍有限。有学者分析了ctDNA片段在血浆中的长度，并根据ctDNA数据推断出组织DNA拷贝数的变异；证实了肿瘤来源的ctDNA短于非肿瘤来源的ctDNA。Jiang等[23]报道了2例先前未患HCC的HBV携带者，在患者血样中发现存在异常DNA拷贝数，随访过程中这2例患者最终发展为HCC。提示检测ctDNA拷贝数变异有可能成为HCC早期筛查的重要方法。

3.3 血清外泌体 外泌体是一类膜包裹的小囊泡(直径30～120 nm)，由细胞主动释放进入细胞外间隙或体液(如血液、尿液、胆汁或腹水)。外泌体包含细胞特异的蛋白质和核酸(包括mRNA、miRNA和其他非编码RNA)。血清中外泌体的数量约为300万/μL。细胞通过外泌体的穿梭往返在相邻或远隔细胞间传递信号，在细胞损伤和恶变等多种生理和病理过程中具有重要作用。肿瘤细胞可通过外泌体重新编码邻近健康细胞，促进肿瘤进展。

HCC肿瘤细胞能释放高水平外泌体，在HCC形成过程中，癌细胞来源的外泌体介导细胞间miRNA的传递，从而调节受体细胞转化生长因子β活化激酶-1(TAK1)的表达，促进细胞增殖；成人肝脏干细胞来源的外泌体含有肿瘤抑制性miRNA，能抑制HCC细胞的生长和存活；并能使荷瘤小鼠的HCC消退。外泌体介导的RNA和蛋白质交换，不仅在HCC发生发展中起关键作用，而且有可能成为实时非侵入性生物标志物和治疗靶点。He等[24]对3个转移性HCC细胞系进行蛋白质组学和RNA深度测序分析，发现HCC细胞产生的外泌体不同于正常细胞，前者富含致癌mRNA和蛋白质(如酪氨酸激酶受体MET、S100家族成员和小凹蛋白1和2)。同一作者还报道了通过细胞间外泌体传递，可激活PI3K/AKT和MAPK信号通路的分子，赋予非侵袭性肝细胞迁移能力。HCC细胞来源的外泌体通过激活HGF/c-Met/Akt信号通路和抑制凋亡，在肿瘤耐药方面也具有关键作用[25]。需要注意的是，外泌体miRNA是循环miRNA的重要组成，前述HCC相关的外周血miRNA诊断标志物有可能来源于肿瘤细胞释放的外泌体。

4 展望

外周血肿瘤标志物有助于HCC的早期诊断，但单一标志物的作用是有限的。为获得更好的诊断灵敏度和特异度，可联用不同种类的生物标志物，并与肝脏影像学检查结合。另外，体液活检血浆肿瘤DNA的获得率仍较低，还存在与非肿瘤DNA交叉污染等问题，其解决方法有赖于实验技术的进步。尽管HCC中发现了不少具有预后意义的新分子标志物，但目前仍缺乏能真正用于临床的基因标记物。有些已发表的基因标志物仅包括数十个基因，操作方便，效率提高，也节约成本，但可能会影响检测的灵敏度和准确性；有些研究形成的基因标志物高达数百个，检测成本过高，也不便于临床应用。我们仍需继续挖掘现有数据，充分整合分析不同平台数据，进一步评估这些标志物的诊断和预后价值。