反向遗传技术与猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗

李永霞/中农威特生物科技股份有限公司

反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学的认知路线为由表及里，是从生物体自身的性状、表型出发到它的遗传物质来研究生命的发生和发展规律。而反向遗传学则与经典遗传学恰恰相反，是一条由里及表的认知路线，其首先是获得生物体基因组的全部序列，然后对靶基因有目的地进行加工和修饰，如基因插入、基因缺失、基因置换及定点突变等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以确定这些变化对表型性状的直接影响，与之相关的技术为反向遗传技术。

反向遗传技术在生命科学的各个领域应用广泛，且在疫苗研发方面已显示出重要的作用。该技术的问世和发展为生产合适的疫苗株提供了可能，其原因有以下几个方面，第一：相比于传统疫苗株的筛选方法，反向遗传技术改造基因进而获得的疫苗株更直接且更合理；第二：该技术能够消除那些非允许细胞系分离毒株可能带来的污染或其他病原体；第三：通过操作质粒，能够改造影响病毒毒力的基因，去除那些致病因素，进而提高疫苗及疫苗生产的安全性。疫苗免疫依然是防控大部分动物疫病的最有效手段，反向遗传技术的应用为设计和改造疫苗发挥了巨大作用。

反向遗传技术现已成功应用于禽流感、新城疫、口蹄疫等畜禽重大疫病的疫苗研究中，除口蹄疫疫苗外具有代表性的产品有三例：一是重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-1株)，2005年获得一类新兽药注册证书（（2005）新兽药证字3号）；二是利用新城疫LaSota弱毒疫苗反向遗传系统，构建表达不同H5高致病力禽流感病毒HA抗原的重组病毒，成功研制禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rL-H5株），2007年获得一类新兽药注册证书（(2007)新兽药证字03号）；三是重组新城疫病毒灭活疫苗（A-Ⅶ株），2014年获得一类新兽药注册证书（（2014）新兽药证字40号，农业部公告第2169号），其为防控畜禽疫病做出了卓越的贡献。本文主要介绍反向遗传技术在研发口蹄疫疫苗中的应用。

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性，且可快速远距离传播的动物疫病。侵染对象是猪、牛、羊、骆驼等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。发病动物的主要症状是精神沉郁、流涎、跛行、卧地，近查可见口、鼻、蹄和母畜乳头等无毛部位发生水疱，水疱破损后形成溃疡或斑痂。口蹄疫的发病率高，可造成巨大的经济损失和社会影响。该病为世界动物卫生组织法定报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。目前，口蹄疫仍然在世界许多地区流行，实践证明有效的疫苗免疫能够控制口蹄疫大范围的暴发和流行。世界动物卫生组织和泛美口蹄疫中心肯定灭活疫苗免疫是当前防控口蹄疫的最有效手段。中国政府对口蹄疫的防控一直高度重视，有健全的组织机构与防控体系，长期坚持实施 “预防为主、免疫和扑杀相结合”的综合防控措施，取得了举世公认的成效。

反向遗传技术在口蹄疫疫苗中的应用起源于2009年A型口蹄疫Sea-97疫情。2009年，A型口蹄疫Sea-97毒株由东南亚跨区域传播至中国、韩国、蒙古、俄罗斯、朝鲜等东亚和东北亚国家，引起大流行，全世界为之瞩目。世界口蹄疫参考实验室利用国际疫苗毒株库储备疫苗株与之抗原匹配性试验，其匹配值均低于国际标准，无合适疫苗株可推荐。与此同时，国内外有关疫苗研发单位对该流行毒分离株也开展了疫苗种毒驯化筛选工作，但都因病毒产量低、免疫效力差而没有成功。

口蹄疫病毒为单股正链 RNA病毒，基因组全长约 8500个核苷酸(nt) ，由5′端非编码区(5′-UTR)、开放阅读框( ORF)和 3′-UTR 及 Poly( A)尾巴组成。 5′-U TR长约1200 nt，含有S片段、Poly(C)和IRES 等，并在其 5′末端连有一个 VPg。ORF由L基因、P1 结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，长约 6.5 kb，编码一个大的聚合蛋白。此蛋白随后被逐级降解为病毒所需的各个组分 L/L′，P1(1A、1B、1C和1D)、 P2(2A、2B和2C)和 P3(3A、3B、3C 和 3D)。3′U TR 长约 92 nt。Poly(A)尾巴长约100 nt。

疫苗研发团队通过全基因信息解读发现，A型Sea-97毒株3'端非编码区（3'UTR）茎环发生了突变，用单质粒病毒拯救系统证实，该突变将导致病毒在细胞（BHK-21）内的复制水平大幅度降低，从而解释了田间分离的A型Sea-97毒株细胞繁殖力低难以驯化为疫苗毒的原因。其后，该团队利用高复制力型的3'UTR和3D基因构建了制苗种毒拯救框架，同时对A型Sea-97毒株结构蛋白P1基因进行突变修饰，改变了影响病毒结构稳定性的关键氨基酸编码，并将其克隆至上述病毒拯救框架，制备出Sea-97株重组病毒Re-A/WH/09，其病毒抗原产量提高2.25～6.67倍，抗原稳定性提升1倍以上，对A型Sea-97 G1分支毒（A/WH/09）和G2分支（A/GDMM/2013）病毒的匹配性高，抗原关系r值分别为0.94±0.12和0.68±0.06（OIE规定当r≥0.3视为抗原匹配）。

Re-A/WH/09毒株不仅解决了A型口蹄疫Sea-97流行毒的防控问题，同时也解决了世界动物卫生组织（OIE）疫苗毒株库缺少可与Sea-97流行毒匹配的疫苗株问题。2013-2017年，被OIE口蹄疫参考实验室推荐使用。有力推动了口蹄疫疫苗的科技进步，已获得了甘肃专利一等奖（2015）和中国专利优秀奖（2016）。

由此可见，利用反向遗传技术构建疫苗种毒是口蹄疫疫苗创制技术的重大创新和发明，能够解决常规技术难以解决的问题，为继续提升制苗种毒多种性能（如提升产能、诱导早期免疫应答、延长免疫保护期、降低和消除致病性和免疫抑制等）和创制更高效疫苗奠定坚实的基础，将使我国的畜禽疫苗技术跃居国际领先水平。

在成功构建A型疫苗种毒的基础上，疫苗研发团队利用制苗种毒拯救框架对O型Mya-98病毒进行了改造和提升。再通过L、5'UTR和P12A等基因修饰，减弱其致病性，制备出针对O/Mya-98株的重组病毒Re-O/MYA98/JSCZ/2013。该重组疫苗毒的病毒产量明显提高，对家畜致病性减弱，抗原针对流行毒株，提高了疫苗生产效率、免疫效力和疫苗及疫苗生产的安全性。

由中国农业科学院兰州兽医研究所和中农威特生物科技股份有限公司等单位联合成功研制的猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）已于2017年12月11日获得“一类新兽药注册证书（证号：（2017）新兽药证字56号）。中农威特生物科技股份有限公司已于2018年2月23日获得了猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）的兽药产品批准文号，不日产品即可面市。猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株）是国内外首例使用反向遗传技术定向设计和优化构建疫苗种毒的猪用口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗，本疫苗生产和推广使用，对稳定国内O型口蹄疫疫情，防止猪A型口蹄疫疫情间歇性反弹，实现免疫无疫要求等方面具有重要意义。该疫苗的问世，将彻底解决无猪用A型口蹄疫疫苗的历史，有力地支撑了国家防控需求。对规模猪场和养殖户来说，是一场及时雨，不仅有了高效猪用口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗，而且还得到了农业部的官方许可。该疫苗具有以下优势：

（1）具有良好的免疫原性和免疫效力。重组毒株制备的疫苗免疫的宿主抗体应答早且高。

（2）拓宽了疫苗种毒的抗原谱。通过构建重组表位，拓宽抗原谱，提高交叉保护性，可有效防控目前我国现有A型和O型流行毒株。

（3）提高了抗原产能和稳定性。制苗种毒Re-A/WH/09株和Re-O/MYA98/JSCZ/2013株在生产用悬浮BHK-21细胞上很好的生长，抗原产能提高3～10倍。抗原稳定性提高1～3倍。

（4）提高了生物安全性。重组制苗种毒的致病性减弱，从而降低了疫苗及疫苗生产的过程中生物安全风险。

综上所述，反向遗传技术在口蹄疫疫苗的研发方面已取得了很大的突破，其是疫苗研制方面强有力的工具和手段，将会在此方面发挥更大的作用。