巨噬细胞表型转换及其在肾缺血再灌注损伤中作用的研究进展

樊雪梅，容松

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

肾移植术是治疗肾功能衰竭的重要方法。但移植后仍面临着与肾缺血再灌注损伤(RIRI)相关的术后感染、肾功能恢复延迟、移植肾失功能等难题，对短期和长期移植结果有重要影响[1,2]。巨噬细胞是极具异质性和可塑性的免疫细胞之一，研究发现，巨噬细胞与RIRI密切相关，在RIRI过程中发挥抗炎和促炎的双重作用。多种无菌缺血性肾损伤模型实验已证实，巨噬细胞参与了RIRI过程的所有阶段，包括初始损伤、后续修复及晚期纤维化。我们以巨噬细胞为切入点，对其表型转换及其参与RIRI机制的相关研究进行综述。

1 巨噬细胞的起源和异质性

巨噬细胞在固有免疫、恶性肿瘤、代谢和繁殖等系统起关键作用，并以浸润巨噬细胞及组织固有巨噬细胞两种形式存在于体内[1]。前者由骨髓来源的未成熟单核细胞进入血液循环后移行至各组织分化而来，后者则广泛分布于全身各组织，因定居组织不同而命名不同，如分布在肝脏者称为Kupffer细胞，分布在皮肤者称为Langerhans细胞，分布在大脑者称为小胶质细胞。目前认为固有巨噬细胞有三种来源，由血液中造血前体细胞在组织局部分化而来[2]、源于卵黄囊[3]及源于胎肝组织[4]。自发现巨噬细胞以来，探索其在各种病理机制中发挥何种作用一度成为研究热点。大量研究已证实，巨噬细胞具有可塑性和异质性[5]，被作为单核细胞-巨噬细胞谱系的标志。巨噬细胞具有多样性转录谱，可极化为不同亚型以响应微环境的动态变化，从而发挥不同的功能。

2 巨噬细胞的分型、表型转换及功能

目前多数文献将巨噬细胞分为M1、M2两类亚型：经典活化的巨噬细胞(M1)和替代活化的巨噬细胞(M2)。巨噬细胞在干扰素(IFN)、Toll样受体等信号刺激下发生表型转换，极化为M1，在IL-4、IL-13等信号刺激下极化为M2，二者的平衡状态与肾脏微环境相关，可能与巨噬细胞源性转化生长因子-β(TGF-β)抑制诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、刺激精氨酸酶(Arg)及信号转导和转录激活(STAT)、NF-κB等信号通路的调节有关。然而，有学者提出M1/M2分型方法并不严谨，M1、M2是巨噬细胞在不同微环境因素刺激下发生表型转换这一动态过程的两个极端，该分型方法并不能反映该过程的真实性。

多项研究表明巨噬细胞发生表型转换是复杂连续的过程，并非直接由M1转变到M2。如：M2三种附加亚型的研究(М2a由IL-4、IL-13等诱导，发挥组织修复作用；M2b由免疫复合物等诱导，发挥免疫调节作用；M2c由IL-10、TGF-β等诱导，发挥抗炎作用)；Mantovani等[6]认为M2样巨噬细胞具有M2的部分表型特征而非全部特征；Malyshev等[7]提出体内尚不存在纯粹的只表达M1或M2表面标记物的巨噬细胞，且发现巨噬细胞除M1、M2表型外，还存在新的表型——M3转换表型[7]。可见，巨噬细胞的具体分型、表型转换等仍需更深入的研究。但目前广泛使用的是M1/M2分型方法，因其简化了巨噬细胞表型转换的复杂性，便于研究中的描述。

M1、M2的表面标记物也尚未统一。TLR-4、MARCO受体、CD25、CD80可作为M1的表型特征，甘露糖受体、CD163、CD209等可作为M2的表型特征。Sun等[8]报道CD16、IL-1R、IL-12等可为M1的表面标记，通过释放IL-6、TNF-α、IL-1、ROS、iNOS、等炎性细胞因子及CXCL5、CXCL9等趋化因子以招募其他免疫细胞，发挥促炎作用；IL-1R(M2a)、CD86(M2b)、CD150、CD163(M2c)可为M2各类附加亚型的表面标记，释放IL-10、IL-12、TGF-β、Arg-1等因子，发挥抗炎、修复、促纤维化等作用。李康等[9]认为，iNOS、IL-12、CDl6/32可用于鉴定M1；Arg-1、CD206、Dectin-1可用于鉴定M2。探究巨噬细胞表面标记物，以鉴定巨噬细胞亚型是研究其在病理过程中发挥何种功能的重中之重。

关于M1、M2功能的研究已取得一定成果。Gordon等[10]认为，M1可清除入侵微生物及肿瘤细胞并促进Ⅰ型免疫反应，参与初始炎症反应；M2则主要参与碎片清除、血管生成、组织重塑及伤口愈合并促进Ⅱ型免疫反应，在炎症后期发挥重要作用。简言之，M1在组织损伤中发挥促炎作用，M2则参与抗炎、组织修复及纤维化。

3 巨噬细胞在RIRI中的作用

3.1 巨噬细胞促进RIRI的炎症反应 RIRI动物模型实验证实，受损肾小管和内皮细胞可分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质细胞衍生因子-1、IL-6和IL-8等趋化因子及炎性细胞因子，引导巨噬细胞、淋巴细胞等向肾间质快速浸润[11]。巨噬细胞等免疫细胞通过其模式识别受体，识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式(DAMPs)，以介导炎症反应。RIRI发生时，缺血受损的肾组织释放大量DAMPs[12]，如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热休克蛋白(HSPs)等，这些DAMPs与巨噬细胞表面受体结合(如Toll样受体TLRs)，激活巨噬细胞，引发非感染性炎症，促进肾组织损伤[2,13]，此期促炎性巨噬细胞占主导地位，肾小管细胞凋亡显著。Mulay等[14]认为炎症与肾脏损伤在自动放大循环中相互增强，细胞损伤释放DAMP等可通过TLRs激活浸润单核细胞为促炎表型，浸润活化的促炎性巨噬细胞又进一步分泌多种促炎细胞因子，导致坏死性炎症，而抑制这类巨噬细胞可减轻甚至阻止受损肾免疫病理学的进展。

RIRI发生后，巨噬细胞是啮齿类动物肾小管周围聚集的主要细胞类型之一。研究发现，使用脂质体氯膦酸盐(LC)使巨噬细胞减少或缺失，可减轻肾形态学损伤及减少尿素氮和肌酐的增加，抑制细胞因子、预防或消耗巨噬细胞等炎性细胞归巢，可降低模型形态和功能的损伤。损伤肾中的巨噬细胞经历从M1到M2表型转换的动态变化。M1产生活性氧、氮中间体等效应分子，IL-1β、TNF、IL-6、IL-12等炎性因子及MCP-1、CCL2、CXCL10、CXCL11等趋化因子促进组织损伤，同时还高表达iNOS，以分解L-精氨酸为瓜氨酸和NO，NO的大量聚集可致组织损伤[15,16]。Inoue等[17]新近的研究认为，M1表达巨噬细胞诱导的C型凝集素(Mincle)可介导肾急性期损伤，Mincle的表达受TLR4/NF-κB信号传导调节，它通过酪氨酸激酶(Syk)/ NF-κB信号通路维持M1的炎性表型，促进iNOS、MCP-1、TNF-α等炎性因子的产生，最终导致肾损伤，而抑制Mincle的表达则有肾保护作用。因此，控制RIRI中M1介导的炎性反应，可为移植肾存活提供良好的微环境，是肾移植领域值得努力的方向。

3.2 巨噬细胞参与RIRI的修复 RIRI时肾小管受损，管状细胞显著增殖，修复过程即启动，于第3天达峰值，随后1周内缓慢下降。在此修复期研究中发现，巨噬细胞经历了表型变化并发挥着保护和修复作用。Lin等[18]研究发现，巨噬细胞缺乏时肾上皮细胞中典型的Wnt通路反应减少，肾修复大大减弱；使用Wnt途径调节剂后修复增强，表明巨噬细胞源性Wnt7b(Wnt通路配体)在修复和刺激肾上皮细胞再生中起重要作用，印证了巨噬细胞参与受损肾的修复过程。进一步追踪荧光标记的促炎性M1实验发现，修复期肾中的 M1可转换为M2，巨噬细胞经历了促小管炎症损伤到支持小管修复的表型转换。相似地，Cao等[19]认为 RIRI后M2可刺激肾小管上皮细胞在内的多种细胞增生，这可能与M2抑制M1、减少促炎因子及iNOS的产生有关。M2还可表达高水平Arg-1、甘露糖受体(MR)及IL-10等[20,21]，Arg可与 iNOS竞争性结合同一底物L-精氨酸，将其裂解为脯氨酸和多胺，促进细胞分裂和胶原形成，从而发挥其促修复作用，另外，多胺又可促进巨噬细胞向M2转换，进一步对损伤组织进行修复和重塑。IL-10是公认的内源性抗炎因子代表之一，主要来源于巨噬细胞和Th细胞，也可以由损伤肾小管上皮细胞产生，一定浓度的IL-10可抑制 MCP-1、IL-2、INF-γ、IL-8、IL-1、TNF-α等炎性因子的产生，发挥其抗炎促修复作用[22]。在RIRI修复期，用LC敲除小鼠巨噬细胞后可使小鼠肾损伤加重，表明此期的巨噬细胞发挥肾脏保护作用与其高表达IL-10及抑制TNF-α分泌有关[23]。此外，Huen等[24]研究发现，体巨噬细胞修复表型的激活机制与肾近端小管细胞分泌的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，一种STAT5的激活剂)上调相关，GM-CSF受到STAT5通路的调节，而体内、体外GM-CSF功能的阻断性实验也证实该阻断可减弱巨噬细胞的替代激活，导致修复期肾小管细胞增殖减少。尽管巨噬细胞诱导肾脏修复的具体机制仍在争论中，但随着研究的不断深入，已确定可增加有益因子的释放、阻断损伤表型激活通路、促进修复表型激活通路、控制炎性环境、保持M2表型稳定等，因此以M2为基础的细胞疗法仍然值得期待。

3.3 巨噬细胞参与RIRI后的纤维化 持续的炎症反应是RIRI后慢性肾脏疾病发生的重要原因，包括巨噬细胞在内的多种炎症细胞、炎症因子参与受损肾组织的纤维化。通过抗巨噬细胞血清或LC消除巨噬细胞可减少持续性炎症及随后的纤维化发展。实验研究表明，巨噬细胞可刺激和释放TGF-β1、MCP-1、血小板源生长因子(PDGF)、IL-l等促纤维化因子，这些因子不仅可诱导肾脏某些固有细胞(如肾间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞等)活化为成肌纤维细胞(可合成细胞外基质而促进肾脏纤维化)，还可抑制细胞外基质降解酶，加快肾纤维化[25]。TGF-β1是肾纤维化的关键调节因子及公认的肾纤维化指标之一，不仅可诱导成肌纤维细胞通过Smad 信号通路促进细胞外基质形成，还能通过减少基质金属蛋白酶等促进细胞外基质降解，进一步加重纤维化进展。此外，TGF-β1还可直接促进胶原的合成。巨噬细胞在一定刺激下(如LPS、IL-1、IFN-γ、某些病毒)高表达MCP-1，MCP-1又可直接趋化巨噬细胞进入受损组织，该相互作用导致二者在组织大量聚集和累积，使肾脏炎症持续。持续的M2浸润可能导致某些伤口愈合生长因子的持续产生，最初的组织修复机制可能进展为有害的纤维化。因此巨噬细胞也被认为是导致肾纤维化的重要因素，控制巨噬细胞活化和浸润能预防RIRI后肾纤维化的发展。

4 巨噬细胞在RIRI中的研究方向

巨噬细胞具有可塑性、异质性，广义上根据不同微环境刺激情况被分为经典活化的M1型和替代活化的M2型，分别在组织损伤中发挥促炎和抗炎及促纤维化作用。但目前根据刺激物不同，对巨噬细胞亚型进行分类的方法值得我们深思：活体微环境中通常有多种刺激因子同时存在，共同影响着巨噬细胞，此时巨噬细胞会向哪一种表型转换？此时仍根据刺激因子类型来区分巨噬细胞亚型及M2附加亚型是否合理？可见，对巨噬细胞分型及表型转换的研究仍任重道远。不论巨噬细胞如何分型、如何发生表型转换，其在病理过程中发挥损伤与修复的双向作用是明确的，这使我们对以巨噬细胞为基础的细胞疗法有了信心，进一步研究诱导巨噬细胞向有益表型转换并使之保持稳定，调控甚至阻断其向有害表型转换，这也是以巨噬细胞为基础的、更好地提高临床器官移植成功率、存活率的研究方向。目前的研究已证实，巨噬细胞可转换为M2修复表型，这些成果使输注M2及其相关因子用于治疗肾脏疾病的方法成为可能，且已有诸多动物实验证实输注M2a、M2c等细胞对动物模型的治疗作用。

但我们也面临着挑战，例如巨噬细胞的许多中间表型可能共存于同一组织中，对其极化和不同表型功能机制的研究尚不透彻，如何在保证诱导修复表型的同时，阻断其他有害表型的极化尚不明确；修复表型的引入是否会带来组织细胞恶性增殖的威胁及过度修复以致纤维化尚不明确；人类RIRI的治疗中，如何得到纯合且表型保持稳定的M2，同时如何把握输注时机、剂量尚不明确。因此，在缺乏关于人类巨噬细胞类型及其可塑性、功能型的研究背景下，基于巨噬细胞的细胞疗法在用于人类之前仍需大量临床研究的支持。