高血压病气虚血瘀证患者血清凋亡相关蛋白含量测定及意义※

● 胡小勤 黄大利 蒙玉梅 吴 培 王 强

高血压病是临床常见的一种疾病[1]，气虚血瘀证是高血压病的常见证型[2]，也是血瘀证的常见亚型[3]。高血压病[4]以及气虚血瘀证[5]都与细胞凋亡密切相关。笔者在以往的体外实验中发现，高血压病气虚血瘀证患者血清可以诱导血管内皮细胞凋亡[6]，但是高血压病气虚血瘀证患者体内细胞凋亡的情况尚不清楚。

细胞凋亡(apoptosis)是指多细胞生物为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程[7]。Caspases家族的激活是凋亡进行的必须途径。其中，Caspase-3是整个凋亡级联反应的一个关键调节点[8]。P53基因对凋亡有诱导作用[9]。Fas与其配体FasL结合可诱导Fas表达细胞发生凋亡，是细胞凋亡最主要的途径之一[10]。

因此，为了进一步阐明高血压病气虚血瘀证与细胞凋亡的关系，本文检测了高血压病气虚血瘀证患者血清凋亡相关蛋白Caspase-3、P53、Fas、FasL的含量，并分析其临床意义。

1 材料

1.1试剂ELisa试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.2仪器台式低温离心机为Thermo公司产品；全波长酶标仪为Biotek公司产品；微量移液器为Eppendorf公司产品。

2 方法

2.1患者及健康体检者的选择选择高血压病气虚血瘀证、高血压病非气虚血瘀证患者各40例，为2016年7月至2017年1月期间广西中医药大学第二附属医院心血管内科高血压病确诊者。高血压病诊断按照2013ASH/ISH高血压管理指南的诊断标准。气虚血瘀证，按照我国1986年修订的气虚证诊断标准(全国中西医结合虚证及老年病防治学术会议制订的《中医虚证辨证参考标准》)及2011年修订的血瘀证诊断标准(中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的《血瘀证中西医结合诊疗共识》)。健康对照组选择健康体检者20例，三组在性别和年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)；高血压病气虚血瘀证、高血压病非气虚血瘀证患者的血压无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

2.2人血清收集空腹取血后，置入不抗凝无菌带帽干燥试管，自凝后，4℃，2000r·min-1离心15min，取上清液置无菌EP管，混匀，灭活，过滤除菌，冻存于-80℃，备用。用于实验的血清分别为各组患者及健康体检者的混合血清。

2.3分组分3组，分别是高血压病气虚血瘀证组、高血压病非气虚血瘀证组、健康组。

2.4 ELISA检测各组血清蛋白含量按ELISA试剂盒说明进行检测。

3 结果

3.1各蛋白标准曲线图见图1～4。

3.2血清中各蛋白含量

3.2.1 各组血清中Caspase-3、P53含量 关于Caspase-3，高血压病气虚血瘀证组、高血压病非气虚血瘀证组与健康组比较，含量均明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01；高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01。

关于P53，高血压病气虚血瘀证组与健康组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01；高血压病非气虚血瘀证组与健康组比较，含量无明显变化；高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01。见表1。

表1 血清中Caspase-3、P53含量

注：与健康组相比，**P<0.01；与高血压病非气虚血瘀证组相比，△△P<0.01。

3.2.2 各组血清中Fas、FasL含量 关于Fas，高血压病气虚血瘀证组与健康组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01；高血压病非气虚血瘀证组与健康组比较，含量显著升高，差异有统计学意义，P<0.01；高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，含量升高，但无统计学差异，P>0.05。

关于FasL，高血压病气虚血瘀证组与健康组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01；高血压病非气虚血瘀证组与健康组比较，含量显著升高，差异有统计学意义，P<0.01；高血压病气虚血瘀证组与高血压病非气虚血瘀证组比较，含量明显升高，差异具有统计学意义，P<0.01。见表2。

表2 血清中Fas、FasL含量

注：与健康组相比，**P<0.01；与高血压病非气虚血瘀证相比，△△P<0.01。

4 讨论

经典的细胞凋亡途径有两条，分别为细胞外途径(或称细胞表面死亡受体途径)和细胞内途径(或称线粒体引发途径)[11]。

研究表明：细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应(cascade)事件的结果，caspase-3被证实处于该级联反应的下游，是凋亡的关键执行者[12]。

P53蛋白具有确切的促进细胞凋亡的功能。通过Bax/Bcl-2、Fas/Apol、IGF-BP3等蛋白，P53可完成对细胞凋亡的调控作用。P53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达，通过线粒体途径共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，如TNF受体和Fas蛋白[13]。

Fas/FasL系统在细胞凋亡信号的转导过程中尤为重要。Fas是TNF受体家族I型跨膜蛋白及FasL的受体，相对分子质量45kD；FasL是TNF家族II型跨膜蛋白，相对分子质量40kD，Fas与其配体FasL或Fas抗体结合可诱导Fas表达细胞发生凋亡，是细胞凋亡最主要的途径之一[14]。

实验结果表明：与健康组相比，高血压病气虚血瘀证组、高血压病非气虚血瘀证组血清中的Caspase-3、P53、Fas、FasL表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。另外，与高血压病非气虚血瘀证组相比，高血压病气虚血瘀证组Caspase-3、P53、FasL表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与以往的关于上述蛋白在细胞凋亡的作用的研究结果一致[15-17]。本实验结果说明：高血压病气虚血瘀证患者存在细胞凋亡，其机制可能与Caspase-3、P53、Fas、FasL表达量升高有关。其中，与气虚血瘀证密切相关的蛋白主要为Caspase-3、P53、FasL。具体的凋亡途径，初步判断与Fas/FasL途径有关，至于与其他受体及线粒体途径是否相关，有待于进一步研究。

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