结直肠癌中miR—106b增强肿瘤细胞放疗抵抗作用机制的初步分析

杨丽君 万晓晨

[摘要] 目的 探讨结直肠癌中miR-106b增强肿瘤细胞放疗抵抗作用机制。 方法 采用RT-PCR技术检测结直肠癌细胞株当中的miR-106b的表达，分析其对放疗抵抗的影响。 结果 检测SW620细胞放疗敏感性，miR-106b过表达之后SW620细胞的生存分数显著高于对照组（P<0.05）；检测miR-106b抑制表达的SW480细胞放疗敏感性，miR-106b稳定干扰之后SW480细胞的生存分数要显著低于对照组（P<0.05）；平板克隆实验结果表明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖能力显著强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05）。 结论 miR-106b可以强化细胞抵抗射线导致的DNA损伤，提高细胞修复DNA的能力，最终强化结直肠癌细胞放疗抵抗作用。

[关键词] 结直肠癌；miR-106b；肿瘤细胞；放疗抵抗；机制

[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）01-0029-03

Preliminary analysis on the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer

YANG Lijun WAN Xiaochen

Clinical Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer. Methods The expression of miR-106b in colorectal cancer cell lines was detected by RT-PCR. Its impact on radioresistance was analyzed. Results The radiosensitivity of SW620 cells was detected. The survival score of SW620 cells after miR-106b overexpression was significantly higher than that in the control group（P<0.05）； the radiosensitivity of miR-106b to inhibit the expression of SW480 cells was detected， and the survival score of SW480 cells after miR-106b stable interference was significantly lower than that in the control group（P<0.05）； the results of plate cloning experiments showed that the cell proliferation of SW620/plVTHM/miR-106b cells was significantly stronger than that of SW620/plVTHM cells（P<0.05）. Conclusion miR-106b can enhance the cell resistance to radiation-induced DNA damage， improve the ability of cells repairing DNA， and ultimately enhance the radioresistance of colorectal cancer cells.

[Key words] Colorectal cancer； miR-106b； Tumor cells； Radioresistance； Mechanism

結直肠癌发生发展同遗传因素以及环境因素等存在密切联系，统计结果显示，结直肠癌临床发病率近年来呈现出明显升高的发展趋势。当前情况下，结直肠癌患者的治疗主要是手术治疗联合辅助放疗[1]。有效放疗可以杀死癌症细胞，同时延长细胞周期，改善手术治疗效果。不过部分患者的放疗敏感性比较低，远期效果不够理想，因此放疗抵抗作用机制成为结直肠癌研究的一个热点问题[2]。本文研究结直肠癌细胞株当中的miR-106b表达，探讨其同放疗抵抗之间的联系，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

人结直肠癌细胞株SW480及SW620，动物小鼠购自省动物中心， 3～6周龄，雌雄各半，体重（20±2）g。恒温恒湿条件下饲养，确保无特定病原体。

1.2方法

1.2.1 细胞培养方法 SW480及SW620借助于慢病毒转染过表达或者是干扰细胞株的培养箱当中进行培养，设定温度37℃，5%的CO2，细胞应用10%的牛血清RPMI-1640培养基，添加50 U/mL青霉素，50 mg/mL的链霉素，于37℃、5%CO2培养箱内培养，应用0.5%的胰蛋白酶进行消化传代，选取处于指数生长阶段的细胞进行实验[3]。

1.2.2 配置试剂 细菌培养基的配制方面，LB液体培养基，主要成分为5.0 g的胰蛋白胨、10.0 g的酵母提取物、5.0 g的氯化钠，添加500 mL去离子水之后搅拌，pH值升高至7.0，分装之后高压灭菌储存[4]。添加抗生素当作培养基，LB固体培养基方面，在液体培养基当中添加2.5%的琼脂粉，在高压灭菌之后冷却，混匀之后每个平板倒入20 mL的培养基，常温条件下冷却到凝固并且使用保鲜膜进行封装[5]。

1.2.3 细胞辐射处理及检测 使用5%的胰酶消化细胞制作得到单细胞悬液，分析细胞的浓度，接种到6孔板，在培养箱当中持续孵育9 h之后，应用Varian 2300加速器进行6MV-X线照射，其中剂量率是2 Gy/min，细胞覆盖1 cm玻璃，完成剂量建成之后终止培养，并且吸去培养液。每孔当中添加150 μL的DMSO持续振荡5 min之后检测OD490 nm位置的具体数值[6]。

1.2.4 细胞辐射之后检测对克隆的影响 两组细胞接种到6孔板中，每组分成0 Gy、l Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy等不同的剂量，每个剂量组设置3个不同的复孔[7]。照射之后的细胞置于常温条件下持续培养2周，期间根据pH值情况更换培养液。培养板孔当中发现肉眼能够发现的克隆之后停止培养，去除培养液之后PBS清洗细胞反复冲洗[8]。应用甲醇持续固定，之后去除甲醛，应用1%的结晶紫乙醇溶液进行染色，洗去染液之后干燥，并应用显微镜统计50个以上的克隆，从而计算克隆率（克隆数/细胞数×100%）及存活分数（受照射细胞克隆率/对照细胞克隆率×100%）。将3次照射得到的存活分数平均值当作结果[9]。

1.2.5 细胞周期实验 指数生长期的细胞在经过0 Gy或者是2 Gy照射之后24 h及48 h后收集细胞，使用PBS反复洗3遍，3000 r/min持续离心10 min，细胞沉淀储存到离心管当中，吸净上清之后使用振荡器充分震荡，添加l mL的冰乙醇，次日离心去除上清并应用PBS反复冲洗，添加50 μL的PBS及100 μg/mL RNA酶，在常温条件下水浴1 h，染色之后使用100目的尼龙网进行过滤，应用细胞仪分析各个细胞时相占据的百分比[10]。

1.2.6 放疗敏感性 将两组细胞制作成为单细胞悬液，使用1640培养基确定细胞的浓度为1×106/mL。在小鼠皮下接种0.1 mL的细胞悬液，实验过程当中每3天使用游标卡尺来确定肿瘤最大径及垂直横径，肿瘤体积约为200 mm3之后应用8 GyX线进行照射。每组4只用来计算抑瘤率，抑瘤率=（1-实验组体积/对照组体积）×100%[11]。

1.3统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，样本均数对比应用随机设計的独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-106b转染SW620细胞放疗后增殖能力对比

检测SW620细胞放疗敏感性，miR-106b过表达之后SW620细胞的生存分数显著高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2稳定干扰miR-106b表达放疗处理后SW480细胞放疗敏感性对比

检测miR-106b抑制表达的SW480细胞放疗敏感性，miR-106b稳定干扰之后SW480细胞的生存分数要显著低于对照组（P<0.05），见表2。

2.3 SW620 miR-106b过表达前后克隆形成率及存活分数对比

平板克隆实验结果表明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖能力显著强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05），见表3。

3 讨论

随着我国居民物质生活的改善，结直肠癌的临床发病率日益上升，且患者的病死率较高。研究人员从miRNAs及生物标志分子等不同领域探索直肠癌放疗抵抗作用机制，结果提示不同层面的分子机制存在明显的区别，且互相存在影响。肿瘤干细胞及放疗抵抗之间的联系受到研究人员的重视[12]。有研究表明miRNAs影响到生命过程的各个环节，如发育、细胞代谢、细胞凋亡及细胞分化等，通过这一途径影响到免疫功能[13]。miR-106b长度为2 Int，位置在染色体7q22-1，所属的基因簇较为保守，主要以多顺反子形式共同转录，其平行表达在肝、胃及前列腺等肿瘤当中都表现得较为明显[14]。研究人员借助于基因芯片发现结直肠癌当中miR-106b表达要显著高于附近的健康组织，miR-106b一方面在肿瘤病变位置的表达异常，另一方面在循环系统血液当中的表达同样显著上升，在结直肠癌患者血液当中的miR-106b的水平要显著高于健康人群[15]。这提示miR-106b对肿瘤增殖环节有重要影响，不过在肿瘤放疗环节当中的影响还缺乏相关的研究。本研究检测SW620细胞放疗敏感性，结果显示miR-106b过表达之后SW620细胞的生存分数显著高于对照组（P<0.05）。

有研究人员发现miR-106b在刺激肿瘤增殖环节，可以加速结直肠癌从G1期向S期的过渡，而G1期及S期是放疗的敏感期及抵抗期[16]。通常情况下，高分化肿瘤对放疗的敏感性比较差，低分化肿瘤细胞的放疗敏感程度较高，相关研究发现高分化细胞株SW480的放疗敏感性比较差，而低分化细胞株SW620对于放射治疗仍然较为敏感[17]。本研究中，高分化细胞株（SW480）当中的miR-106b表达要显著高于低分化的细胞株（SW620），并且表达水平同放疗敏感性存在显著相关性。借助于一系列实验，如平板克隆实验、体外增殖实验等，我们发现低表达的SW620细胞对放疗作用仍然有着比较强的敏感性，过表达的SW620对放疗抵抗的作用较为明显。实验结果提示miR-106b可以借助于强化结直肠癌细胞抗凋亡的能力，来加速细胞G1/S期的过渡，从而强化放疗抵抗作用。

本研究中，检测miR-106b抑制表达的SW480细胞放疗敏感性，miR-106b稳定干扰之后SW480细胞的生存分数要显著低于对照组（P<0.05），同时平板克隆实验结果表明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖能力显著强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05）。这提示miR-106b可以增强细胞抵抗射线导致的DNA损伤，强化细胞DNA损伤之后的自我修复功能，通过这一途径强化细胞放疗抵抗作用[18]。简言之，随着肿瘤免疫学、分子生物学及生物医学工程等学科的进步，靶向治疗的临床应用日益广泛，为逆转结直肠癌患者的放疗抵抗作用提供了新思路，少数新药开发及具体应用的效果良好[19]。随着医学研究的持续深入，相信通过深入分析结直肠癌患者的放疗抵抗作用机制，同靶向药物的研究相结合，将进一步改善结直肠癌辅助放疗的效果[20]。

综上所述，miR-106b可以强化细胞抵抗射线導致的DNA损伤，提高细胞修复DNA的能力，最终强化结直肠癌细胞放疗抵抗作用。

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（收稿日期：2017-10-25）