瞬时受体电位香草酸受体4与乳腺癌转移、血管新生的关系研究进展

冯泽宇，卞卫和，姚昶

(南京中医药大学附属医院，南京210029)

近年来，乳腺癌的发病率逐年升高，目前临床尚无有效治疗方法。乳腺癌晚期常发生转移，严重影响患者生活质量。瞬时受体电位(TRP)通道是一系列非选择性的阳离子通道，能够在细胞内外环境的多种刺激下激活，参与机体各种重要的生理、病理过程。哺乳动物中TRP蛋白家族分布广泛，根据其结构同源性可分为TRPC 、 TRPV、TRPM、TRPP 、TRPML 、TRPA (ankyrin)、 TRPN 等7个亚族[1]。研究[2]发现，钙离子内流途径的重塑与肿瘤细胞的增殖、迁移密切相关。TRPV家族有6个成员，均为机械敏感性离子通道，在哺乳动物体内作为细胞感受器存在。瞬时受体电位香草酸受体4(TRPV4)是一种非选择性阳离子通道，可通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移及血管生成等途径在肿瘤的发生、发展中发挥作用[3]。现将TRPV4的结构和功能及其在乳腺癌细胞迁移、血管新生的关系相关研究综述如下。

1 TRPV4的结构、功能及活性调控

TRPV4最初从大鼠肾脏分离得到，作为线虫基因osm-9的脊椎动物同源基因而被确认。TRPV4在染色体定位于12q24.1，包含12个外显子，由871个氨基酸残基组成，其蛋白的氨基端与羧基端皆位于细胞膜和内质网膜内表面。与其他TRP一样，TRPV4具有6个螺旋跨膜结构，其中前四次跨膜区表现出较弱的电压传感性能，而在其第5和第6次跨膜区之间则嵌有发卡样通道结构，用于渗透阳离子。TRPV4为单向阳离子通道，钙离子、钠离子和镁离子均能经该通道流入细胞膜和内质网膜内，外向电导系数为90～100 PS，内向电导系数为50～60 PS[4]，其对钙离子具有适中的通透性，PCa / PNa为6[5]。

先期研究[6]表明，TRPV4能够调控细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学行为。在许多生理病理状态下，TRPV4的异常表达已经被证明能够改变渗透压感知，损害血管内皮功能，抑制破骨细胞的分化导致骨质增生以及产生压力、疼痛感觉障碍，而TRPV4的突变会导致骨骼发育不良及神经病变等功能异常疾病[7, 8]。

TRPV4可以在细胞对低渗的响应机制中被激活，是一种机械力及渗透压感受器。中等热量(>24 ℃～27 ℃)即可激活TRPV4，其机制尚不完全明确。因此，正常体温下可出现TRPV4基础活性的升高。同时，温度反复升高会逐渐减少TRPV4的激活[4]。TRPV4可被内源性大麻素及其代谢产物花生四烯酸等多种内源及外源化学刺激直接激活，细胞内G偶联蛋白受体及机械感受体的细胞内信号传导途径也可直接激活TRPV4；另一方面，TRPV4也能被间接激活或敏化，如丝氨酸162、189、824及苏氨酸175、酪氨酸110、805的磷酸化均能改变细胞对渗透压、温度以及TRPV4的激动剂的敏感性从而激活TRPV4；而炎症介质、蛋白酶激活受体2(PAR2)的激活、Rho激酶以及PKA的cAMP的活化则能通过改变细胞对机械力的敏感性从而敏化TRPV4[9]。

早期研究使用非选择性的TRPV4抑制剂钆和钌红，但激活效果较差。TRPV4靶向激活剂包括佛波酯4α-佛波醇12,13-十二烷酸酯(4αPDD)、GSK1016790A及新型TRPV4抑制剂。新型TRPV4抑制剂包括RN-1734、HC-067047(目前临床广泛使用)和GSK2193874(口服生物可利用)，具有亲和力高、特异性好等优点[10]。

2 TRPV4与乳腺癌细胞迁移的关系

早期研究[11]发现在小鼠正常乳腺上皮细胞中TRPV4的选择性定位于基底外侧膜，激活TRPV4通道使得钙离子内流，从而激活大电导--钙离子激活的钾通道(BK通道)，同时小分子溶质间通透性缓慢增加，说明TRPV4对乳腺上皮细胞通透性起着双相调节作用。TRPV4在乳腺癌中的表达呈现出了明显的分子分型差异，其中三阴型乳腺癌中TRPV4的表达要高于激素受体阳性及Her-2过表达型的乳腺癌。既往的研究显示高表达的TRPV4对乳腺癌细胞生物学行为的影响主要体现在促进肿瘤细胞迁移，而对肿瘤细胞本身的增殖影响不 大。尽管目前看来TRPV4敏感性与特异性尚不足以使之成为特定类型乳腺癌的检测标志物，但或许能帮助乳腺癌的早期诊断以及预后判断提。

Jung等[12]发现TRPV4在人乳腺癌T47D上皮细胞表达，而孕激素能下降其mRNA及蛋白质水平。此外，孕激素导致的TRPV4基因表达减少也减弱了人乳腺癌上皮细胞钙离子信号通路功能。Dhennin-Duthille等[13]利用乳腺导管腺癌(hBDA)组织原代培养了乳腺癌上皮细胞(hBCE)，随后检测了TRP通道在hBDA、hBCE及MCF-7细胞中的表达情况，结果发现在这三种模型中TRPV4均呈高表达。Lee等[14]通过对761例乳腺癌患者肿瘤组织样本的分析发现TRVP4在浸润性导管癌组织以及转移灶中的表达显著高于正常组织，TRPV4表高达的患者OS及PFS与低表达患者存在显著差异，他们同时发现TRPV4的表达程度与肿瘤直径及乳腺癌分级呈正相关，也与基底亚型患者较差的DMSF相关。Wen等[15]分析了1 881例乳腺癌者肿瘤样本，发现基底样型乳腺癌肿瘤组织中TRPV4的表达显著高于Luminal A型、Luminal B型以及Her-2过表达型，同时他们发现TRPV4的表达在ER阴性的乳腺癌中表达要高于ER阳性的乳腺癌，并且TRPV4的表达与上皮间充质转化评分显著相关。Peters等[16]在对845例乳腺肿瘤样本的分析中也发现了TRPV4的表达在基底型乳腺癌中的表达要高于其他分子分型，TRPV4的过表达或许是基底型乳腺癌部分亚型的特征表现。

TRPV4的激活可抑制神经内分泌细胞的迁移，却能促进肺动脉平滑肌细胞的迁移[17]。 Fiorio等[18]发现激活TRPV4后，乳腺癌来源的内皮细胞(BTEC)的细胞迁移速率明显高于正常人人微血管内皮细胞(HMVEC)，且高于未被激活TRPV4的BTEC的细胞迁移速率。而当TRPV4的表达降低时，由花生四烯酸(AA)诱导的BTEC迁移随之被完全抑制，TRPV4介导的钙离子信号明显增多。Mrkonjies等[17]利用野生型与渗透压/热不敏感TRPV4突变体探讨TRPV4在肿瘤细胞迁移过程中的作用机制，过表达TRPV4-121AAWAA(缺乏相应磷酸肌醇结合位点和对生理刺激的反应)的人乳腺癌T47D细胞中黏着斑的区域和强度要高于TRPV4-WT过表达组，而当敲减了T47D细胞中内源性表达的TRPV4，黏着斑的区域和强度也都相应减少。表明TRPV4可通过促进黏着斑生长，调控乳腺癌细胞迁移。Wen等[15]发现敲除TRPV4表达或抑制TRPV4功能均可以有效抑制小鼠转移性乳腺癌细胞4T07的迁移和侵袭。进一步研究发现，虽然TRPV4过表达并没有改变MCF-7细胞的侵袭性和趋化能力，也不能促进MCF-7或MB468细胞的跨内皮迁移能力，但TRPV4过表达的MB468细胞的侵袭性和趋化性均有显著增加。

体内实验[16]发现沉默TRPV4后，注射4T1细胞的小鼠肺部转移结节数量大幅减少，而结节大小没有明显的改变，提示TRPV4或许不影响肿瘤生长及增殖，但其高表达促进乳腺癌细胞的转移。TRPV4可能是通过调节细胞肌动蛋白皮层及细胞骨架蛋白改变了细胞的刚度，使肿瘤细胞具有更柔软的机械特征因而易于形变，塑造出转移所需的细胞形态，并且促进细胞外渗，使癌细胞变得更具侵袭性从而导致肿瘤转移。最近的研究[17]表明， TRPV4的激活能够使AKT及FAK磷酸化，同时下调E-cadherin及β-catenin，这或许与细胞内钙离子浓度增加相关。其中AKT被证明在TRPV4介导的E-cadherin下调及细胞的跨内皮迁移其关键作用，而这种TRPV4对AKT及E-cadherin的调节作用在小鼠4T07细胞及人乳腺癌细胞系MCF-7中均能被观察到。此外，质谱分析结果也提示TRPV4在调节包括细胞骨架以及细胞外基质重塑在内的蛋白网中起到重要作用[14]。

3 TRPV4与肿瘤血管生成的关系

乳腺癌作为实体瘤，其生长与转移离不开血液供应。TRPV4作为机械传感器，在血管内皮细胞中有着广泛的表达，同时也在肿瘤血管形成的过程中起着重要的作用[19]。Fiorio等[21]发现AA能够通过调节细胞骨架重塑、激活TRPV4通路从而调节肿瘤血管生成，cAMP/PKA信号通路调节的血管形成以及钙离子内流在BTEC迁移中起到重要作用，这与内皮型一氧化氮合酶的磷酸化和活化以及NO的释放有关，而正常组织内皮细胞中并没有观察到同样的结果。TRPV4是PKA磷酸化的底物，并且受到AA及其代谢产物的调节，AA能够激活钙离子内流进而促进BTEC中的小管形成，并且这种现象特异性地发生在肿瘤血管形成的早期，随着小管结构的固定，钙离子信号明显降低。

阻断钙离子内流后，BTEC中的小管形成随之被抑制[20, 21]。肿瘤新生血管往往存在结构和功能的异常，表现为形态的扩张曲折以及渗透性的改变。Adapala等[22]发现敲除TRPV4的小鼠其肿瘤血管与野生型相比有着更高的密度及通透性，且表现出明显的扩张和畸形，及其制可能是TEC中TRPV4介导的钙离子内流减少，从而导致了对细胞外基质的反常机械敏感性，并发生异常的血管新生。当TRPV4活化剂GSK1016790A与顺铂联用时小鼠肿瘤生长降低，单独使用GSK甚至会促进肿瘤生长。Thoppil等[23～25]发现TRPV4的缺失可能通过细胞周期相关基因的ERK1/2依赖性调节导致TEC的增殖，同时证实GSK特异性抑制TEC的增殖，但不抑制肿瘤上皮细胞本身。表明TRPV4通道选择性抑制肿瘤内皮细胞增殖从而调节肿瘤血管生成。在进一步探索TRPV4调节血管生成的分子机制的过程中，他们发现TRPV4缺失导致基底Rho活性增加，抑制Rho/Rho激酶通路能够恢复TRPV4KO EC的机械敏感性并驱使血管生成正常化。Rho激酶抑制剂Y-27632结合顺铂可降低TRPV4-KO小鼠的肿瘤生长，说明TRPV4可通过维持Rho / Rho激酶活性的最佳水平促进肿瘤血管新生[26]。

目前关于TRPV4对肿瘤血管新生的作用结论不一。多数学者认为高表达TRPV4的乳腺癌细胞表现出更强的侵袭性，但最新研究指出对于部分过表达TRPV4的乳腺肿癌，使用TRPV4特异性激动剂反而能促使肿瘤细胞凋亡[16]。由于乳腺癌具有高度异质性，TRPV4对乳腺癌的调控可能是多方面的，其过高或过低的表达都会对不同分型或不同阶段乳腺癌的发生、发展及预后产生影响，或许特定的患者群能够从TRPV4相关的靶向治疗中获益。

乳腺癌肿瘤组织中血管高密度及VEGF高表达均提示预后不良，但乳腺癌抗血管新生药物贝伐单抗的临床试验结果却未见统计学差异。TRPV4拮抗剂在多种疾病中具有治疗潜力，TRPV4在人类中的作用及其作为治疗靶标的适宜性目前正在葛兰素史克抑制剂GSK2798745(clinicaltrials.gov NCT02119260)进行人体试验。此外NCT02135861、NCT02497937等TRPV4抑制剂也处于临床试验阶段。由于TRPV4在整个身体中的广泛表达和多种作用，全球TRPV4激动或拮抗作用尚存在一些安全性问题[27]。由于缺乏特异性阻断剂，目前尚未在乳腺癌领域中进行针对TRP通道或钙离子信号传导的临床治疗。TRPV4或许能作为乳腺癌血管生成的新靶点。

综上所述，TRPV4是一种非选择性阳离子通道，能够调控细胞的增殖、凋亡、迁移等。TRPV4在乳腺癌组织中的表达存在分子分型差异。高表达的TRPV4可促进乳腺癌细胞的转移。TRPV4在乳腺癌血管内皮细胞中高表达，可通过维持Rho / Rho激酶活性的最佳水平促进肿瘤血管新生。

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