研磨法与冻融法测定湖库叶绿素a的方法探讨

(河北省沧州水文水资源勘测局,河北 沧州 061000)

叶绿素a含量是评价湖泊富营养化程度的重要参数之一。因此，探讨其检测分析方法的实用性具有重要的现实意义。本文对研磨法与反复冻融法测定大浪淀水库中叶绿素a的含量进行了比对分析，结果表明：反复冻融法是最佳的分析方法。

1 实 验

1.1 水样采集

水样来自河北省沧州市大浪淀水库。大浪淀水库于1997年建成，是河北省第一座平原水库，属大(2)型，总投资2.8亿元，蓄水面积16.738km2，设计总库容1.003亿m3，每年可向市区供水8121万m3，是沧州市居民用水的主要水源地。

1.2 主要试剂

90%丙酮溶液、1%碳酸镁悬浊液。

1.3 仪器和设备

可见分光光度计、低温冰箱、离心机、抽滤装置、研钵、微孔滤膜、培养皿、具塞玻璃离心管。

1.4 实验方法

将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，分别使用研磨法和反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%的丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱特征依次测定750nm、664nm、 647nm、 630nm波长下的吸光度，计算叶绿素a的含量。

1.5 实验目的

此次操作设计了两组实验。一组实验是由同一检测人员分析同一样品的多个平行样，且样品的取样体积均相等,检验研磨法和反复冻融法的重现性，结果见表1。另一组实验是由不同的检测人员用不同的提取方法测定叶绿素a，检验不同检测人员分析结果的精密度，结果见表2。

表1 研磨法和反复冻融法比对测定结果 单位：μg/L

2 实验分析与讨论

2.1 两种方法对比试验

两种方法结果比对分析，表明两种提取方法有显著性差异，反复冻融法的方差明显低于研磨法。由标准偏差可以看出，反复冻融法和研磨法的平行样品之间差异显著性不大，反复冻融法实验的重现性高于研磨法，反复冻融法避免了研磨法因多次转移样品带来的操作误差。

表2 不同检测人员研磨法和反复冻融法测定结果比对 单位：μg/L

由表2可以看出，研磨法测定样品的均值和标准偏差相差较大，而反复冻融法测定样品的均值和标准偏差相差不大。这说明对于不同的检测人员利用研磨法测定样品，测定结果差异较大；而不同的检测人员利用反复冻融法测定样品，测定结果无显著性差异。实验证明：采用反复冻融法，只要检测人员按照实验要求去做，就不会因为检测人员不同而影响测定结果，而利用研磨法，检测人员研磨时的力度、方法、转移样品是否完全都会影响测定结果。因此，反复冻融法的实验结果没有因为检测人员的更换而出现大幅度的波动，精确度高。两种方法结果比对分析，表明:两种提取方法有显著性差异，反复冻融法的方差明显低于研磨法。由标准偏差可以看出，反复冻融法和研磨法的平行样品之间差异显著性不大，反复冻融法实验的重现性高于研磨法，反复冻融法避免了研磨法因多次转移样品带来的操作误差。

2.2 破碎液的显微观察

叶绿素a含量的测定，关键环节在于能否将叶绿素从细胞中有效提取出来，多次冷热交替的反复冻融法，提高了细胞的破碎率。在观察细胞破碎的实验中，为了便于观察和计数，采用了实验室培养的栅藻，稀释到一定浓度，进行冻融和研磨，在显微镜下观察破碎情况，计算破碎率，结果表明反复冻融法的破碎率在90%以上，而研磨法的破碎率仅为50%～60%。

3 实验注意事项

实验过程中，使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥，但不要用酸浸泡和洗涤。分析时均使用符合国家标准的A级玻璃量器，分析纯试剂和纯水。整个实验操作应在暗处进行，因为叶绿素提取液对光非常敏感，极易发生光和作用。有关实验数据表明：样品置于暗处，24h内基本不分解，弱光条件下，1h内基本不分解，光照条件下会很快分解，因此，提取后的样品应尽快测定，提取操作等应在低温、暗处进行。

4 试验结果分析与讨论

a.根据实验比对，反复冻融法的相对偏差远远小于研磨法的相对偏差，说明反复冻融法的实验结果没有出现大幅波动，精确度高，同时在实验中发现只要掌握好冻融的时间和室温，细胞的破碎程度也不会因为检测人员的不同而有明显变化。而研磨法的细胞破碎程度与检测人员有很大关系，由于检测人员研磨时的力度、方法均有差异，因而，使用研磨法，检测人员不同，细胞的破碎程度会有明显差异。同时随着研磨时间延长，样品暴露在自然阳光下的时间增加，叶绿素的破坏程度会有所加大。

b.反复冻融和研磨两种方法在测定所需的时间上无明显差异，但是反复冻融法减少了检测人员接触丙酮的时间和次数，保护了检测人员的身体健康，同时反复冻融法所需要的仪器少，故适合大批量的样品分析。

c.反复冻融法操作简单，减少了样品的转移次数，降低了样品的损失，同时提高了细胞的破碎率，避免了研磨不完全而带来的人为误差，提高了实验的准确度和精确性。

d.在处理大批量的样品时，反复冻融法所需的实验器材远远低于研磨法，大大提高了工作效率。

e.对叶绿素a测定值的评价。结果表明：用反复冻融法处理水样具有安全、高效的特性,750nm 处吸光度值容易达到0.005。

5 结 语

反复冻融法所需仪器设备少，操作简便，减少污染，准确度高，适用于大批量样品检测，因此反复冻融法测定叶绿素a具有一定的实用价值。

[1] 赵辛.叶绿素a方法改进的探讨[J].福建分析测试,2007(16):31-32.

[2] 林少君.浮游植物中叶绿素a提取方法的比较与改进[J].生态科学,2005(1)：9-11.

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