DNA损伤修复相关因子在宫颈癌组织中表达的研究

吴 郁 姚 颖 李文静 金一枚 杨 沫 郭红燕

(北京大学第三医院妇产科，北京 100191)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，高居妇科恶性肿瘤第2位[1]。随着宫颈癌筛查的普及和手术、放疗技术的发展，尤其腹腔镜手术的发展[2]，宫颈癌预后得到改善，但是临床上一部分患者诊断时已经晚期，治疗棘手，因此，精确的早期诊断仍然是临床面临的难点。目前，生物标记物相关研究成为疾病早期诊断及预后的热点。DNA损伤修复与肿瘤的发生、发展密切相关，可能会造成DNA错误，诱发肿瘤的发生。磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)与磷酸化毛细血管扩张性共济失调突变因子(phospho-ataxia telangiectasia mutation，pATM)共同参与非同源末端链接(nonhomologous end joining, NHEJ)DNA损伤修复过程，是细胞内对于DNA双链断裂的一种快速敏感的反应，因此，γH2AX可以作为DNA损伤的标记物分子。另外，γH2AX与宫颈癌新辅助化疗后完全缓解率显著相关[3，4]。本研究探讨H2AX与ATM 2个目标分子在宫颈癌中的表达，旨在为宫颈癌早期精确诊断提供新的手段。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月～2017年7月我科就诊的30例宫颈癌(宫颈癌组)，年龄30～62岁，平均45.7岁。FIGO分期：ⅠB1期4 例，ⅠB2期8例，Ⅱ A期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例。HPV16阳性20例，HPV18阳性7例，HPV56阳性2例，HPV阴性1例。病理：鳞癌22例，腺癌8例。对照组选取我科就诊的18例非宫颈癌(年龄44～57岁)，包括子宫肌瘤(13例)、子宫内膜息肉(5例)。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂与耗材 逆转录试剂盒(thermo, K1622)，TRIZOL，无水乙醇，氯仿，异丙醇，荧光定量PCR试剂盒(takara RR420A)，免疫组化试剂盒PV900，苏木素-伊红染色液，γH2AX一抗(CST 2755S，1∶100，兔来源，pATM一抗(NOVUS NB100-306，1∶200，鼠单抗)。qRT-PCR仪[QuantStudio 3 Real-Time PCR(96-well 0.2 ml Block)]，组化湿盒及相关器材，显微镜(日本Nikon ECLIPSE 80i，Nikon corporation)等。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 实时定量PCR 取宫颈癌组和对照组的宫颈组织，Trizol法提取总RNA。Nanodrop2000检测RNA浓度。采用thermo K1622逆转录试剂盒，按照试剂说明书添加逆转录体系，获得cDNA文库。设计H2AX和ATM，β-actin引物。H2AX 上游引物 5’-GTTCCCAGTGGGCCGTGTA-3’，下游引物5’- CTGGTCTTCTTGGGCAGCA-3’；ATM 上游引物 5’-TCGGCATTCAGATTCCAAACA-3’, 下游引物5’-TGAGAAATCTCCAAGGATCTGGT-3’；β-actin上游引物 5’-CTCTCCCTCACGCCATC-3’， 下游引物5’-ACGCACGATTTCCCTCTC3’。 引物由华大基因合成。按照实时定量PCR试剂盒添加体系反应。PCR反应条件：90 ℃，30 s；95 ℃,5 s，60 ℃,30 s(45个循环)；95 ℃,60 s；55 ℃,30 s。

1.2.2.2 免疫组化 ①4%多聚甲醛室温组织固定过夜,修整组织。组织常规石蜡包埋、切片，切片厚度为0.5 μm。②柠檬酸抗原修复缓冲液高温修复。③阻断内源性过氧化物酶。④孵育一抗：滴加γH2AX和pATM一抗，γH2AX和pATM的抗体分别按照1∶100和1∶200稀释。4 ℃孵育过夜。⑤孵育二抗： PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5 min，二抗(HRP标记)按照1∶200稀释覆盖组织，室温孵育50 min。⑥DAB显色，自来水冲洗终止。⑦复染细胞核。⑧脱水封片。结果评估：

宫颈癌组和对照组γH2AX和pATM免疫组化染色结果阳性呈黄色或棕黄色。免疫组化染色的强度和分布采用国际Remmele 评分(international remmele score，IRS)半定量评分系统[5]。染色强度：0分=无，1分=弱，2分=中等，3分=强；阳性细胞百分比：0分=无，1分=<1%，2分=1%～10%， 3分=11%～33%，4分=34%～66%，5分=67%～100%，综合评分最高分8分。综合评分0分记(-)，1～2分记(+)，3～5分记(++)，6～8分记(+++)。-和+代表阴性，++和+++代表阳性。免疫组化染色的评分由2位病理科医生遵循互盲原则进行，二者评分不一致时取均值。

1.2.2.3 HE染色 按照常规方法，石蜡切片脱蜡，常规苏木精-伊红染色，中性树胶封片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 H2AX和ATM 在mRNA水平的表达情况

实时定量PCR分析宫颈癌组和对照组H2AX和ATM的表达，通过相对定量计算方法2-ΔCT，β-actin为内参基因。宫颈癌组ATM mRNA和H2AX mRNA相对表达量较对照组显著高表达，见表1。

表1 宫颈癌组和对照组H2AX和ATM mRNA表达情况

2.2 HE染色和免疫组化

宫颈癌组γH2AX综合评分中位数4分(0～8分)，显著高于对照组中位数0分(0～5分)(Mann-WhitneyU检验，Z=-4.027，P=0.000)；宫颈癌组pATM综合评分中位数5分(0～8分)，显著高于对照组中位数0分(0～5分)(Mann-WhitneyU检验，Z=-4.468，P=0.000)。宫颈癌组γH2AX阳性24例(80.0%)，对照组阳性2例(11.1%)，宫颈癌组显著高于对照组；宫颈癌组pATM阳性 25 例(83.3%)，对照组阳性3例(16.7%)，宫颈癌组显著高于对照组,见表2。HE染色见图1，免疫组化染色见图2。

表2 宫颈癌组和对照组pATM和γH2AX免疫组化综合评分比较

注：-和+代表阴性，++和+++代表阳性

图1 宫颈癌组和对照组HE染色 a.对照组宫颈上皮细胞排列整齐，细胞核形态正常(黑色箭头：正常宫颈上皮)；b.宫颈癌组可见明显癌灶，细胞排列紊乱，细胞核形态消失(黑色箭头：癌细胞) (HE染色 ×200) 图2 宫颈癌组和对照组γH2AX和pATM免疫组化表达情况 a,b.对照组γH2AX和pATM免疫组化(黑色箭头：细胞呈弱阳性)；c,d.宫颈癌组γH2AX和pATM免疫组化均有明显表达，棕黄色或黄色为阳性显色，两者均定位于细胞核( ×200)

3 讨论

在我国,宫颈癌患者每年新发病例约在11万以上，每年有2万～3万女性死于宫颈癌。与其他肿瘤相比，宫颈癌具有明确的致病因素及癌前病变病程进展，通过早期预防和筛查，可以降低发病率和死亡率[6]。性交年龄早、多个性伴侣、早婚、早产、多次流产、肥胖、家族史、高危型HPV16和18感染均可导致宫颈癌的发生。宫颈癌预后与多因素相关，年龄是宫颈癌患者独立预后因素之一[7]。目前，宫颈癌的研究重心已转向对癌前病变的早期发现和治疗[8]。本研究探讨参与DNA双链损伤修复相关因子γH2AX和pATM在宫颈癌中的表达情况，并分析其是否可以作为诊断预测的标记分子。本研究中免疫组化判读结果将“+”判定为阴性，是根据黄晓园等[9]的评分判断方法，以除外非特异性染色的干扰。本研究结果显示二者在mRNA和蛋白质水平宫颈癌组织中表达明显高于对照组(P均=0.000)。因此，γH2AX和pATM因子在宫颈癌的早期诊断有一定临床意义。

DNA损伤是肿瘤发生的明确病因，尤其是DNA双链断裂伴随细胞周期检查点的激活。宫颈癌可能由于DNA损伤导致肿瘤的发生，并伴随DNA损伤修复相关因子的激活[10]。pATM 和γH2AX是参与DNA双链断裂损伤修复的重要因子，ATM活化会进一步激活γH2AX，磷酸化修饰会启动DNA修复和激活检查点的相关途径，从而阻止细胞周期的进展[11,12]。Roossink 等[13]研究DNA损伤修复(DNA damage repair,DDR)组成成分包括pATM在内作为潜在的治疗靶点以及DDR活化在放化疗的宫颈癌患者的预测和预后价值，最终认为宫颈癌患者中pATM对放化疗的保护性意义，并指出pATM抑制可能是促进放化疗的可能途径。γH2AX是磷酸化的H2AX,可以作为宫颈癌患者新辅助化疗的预测因子，但仍需进一步探索[14]。对宫颈癌的特征性信号通路和基因的探索研究显示，ATM 信号通路的激活、细胞周期调控异常、内切酶活性增强和3q 区域的扩增等都有希望成为评价宫颈癌发病风险的指标，提供更好的宫颈癌防治策略[15]。

宫颈癌可通过定期妇科体检达到一定的预防、早期诊断目的，但患者早期症状无特异性，临床误诊、漏诊率较高[16]，诊断缺乏准确性，无论是病毒还是肿瘤相关标记物检测均没有完全准确的手段，感染程度和癌症病程进展关系难以提前预知[17]。早期检出并给予积极的治疗是防治宫颈癌的关键，目前，宫颈癌的诊断多通过TCT、高危型HPV感染、肿瘤相关标记物以及影像学检查等联合诊断[18～21]。本文提出DNA损伤修复因子γH2AX和pATM参与宫颈癌的发生，期望通过对宫颈组织早期检测达到诊断目的。近年来，不断出现新的宫颈癌相关的生物标记，比如ATB(转化生长因子-β诱导激活的一种lnc RNA)的高表达是宫颈癌预后的独立危险因素[22]，PBX3(Pre-B-cell leukemia homeobox 3)[23]和 microRNA-466也同样发现有宫颈癌早期预测，疾病进展以及预后的标记作用[24]。本研究显示宫颈癌细胞中存在显著的γH2AX与pATM激活，即大量的DNA损伤，表明DNA损伤很可能是驱动癌症发生的主要原因之一。除γH2AX与pATM外，细胞内还含有数十种其他DNA损伤响应因子，如MDC1、NBS1、PNKP等。这些因子的功能异常或基因突变都有可能引起DNA损伤修复的失败、基因组紊乱以及最终的癌症发生。因此，检测DNA损伤修复因子的基因表达或相关生化特性，很可能对宫颈癌的早期诊断及分级治疗提供新策略。

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