磁流体热疗治疗肿瘤的研究进展

胡润磊 江洪 马胜林

杭州市第一人民医院（杭州310006）

加热被记载在医学领域用来治疗疾病已有一个多世纪了［1］。根据温度的高低可以将热疗分为热消融（ther⁃moablation）和高热疗法（hyperthermia，HT）两种热疗方式［2］。热消融在临床上作为去除肿瘤的一种手段类似于手术切除肿瘤一样，通常定义为热疗的温度在50℃以上，利用致命水平的热凝固造成不可挽回的蛋白质和其他生物分子的损伤，从而诱导细胞死亡。HT通常定义为温度在41～50℃之间，通过限制一些肿瘤细胞的微观结构功能导致肿瘤细胞凋亡和坏死，而周围正常的组织没有损伤的一种热疗方法。治疗的效果与温度的持续时间、肿瘤区域温度的同质性、肿瘤组织的均一性等因素有关。研究发现，即使在41～42℃的条件下作用1 h，也可以引起明显的肿瘤凋亡、导致坏死［3］。热疗导致肿瘤细胞凋亡和坏死的机制如下：（1）热疗可使肿瘤区域内血流加速（而不是正常组织）从而导致增加灌注和氧合，而肿瘤区域的血管畸形，加速了肿瘤细胞的缺氧，特别是肿瘤中心区域的细胞由于缺氧而引起酸中毒加重，从而造成肿瘤细胞凋亡和坏死［4］；（2）热疗引起细胞周期的变化，从而导致细胞的凋亡坏死；（3）热疗可以引起肿瘤细胞释放肿瘤坏死相关因子抗原，进而引起肿瘤的宿主免疫反应，特别是T细胞免疫反应，从而引起肿瘤细胞的生长抑制。（4）除了肿瘤的生理和微环境的水平，在分子水平上，热疗可以导致蛋白质包括细胞骨架结构，质膜组件，细胞内酶和信号转导分子，热休克蛋白编排、重折叠，以及破坏受损蛋白质与DNA修复相关的蛋白质等因素来导致肿瘤细胞凋亡、坏死［5］。（5）热疗与放疗、化疗有协同作用，可以增强放疗、化疗的抗肿瘤效果。综上所述，理想中的热疗目的是利用最低限度提高的温度来改变靶区肿瘤组织的生理和生物学改变，从而获得较其他方法（如化疗或放疗）更加有效的一种治疗方法［6］。

热疗可以引起抗肿瘤作用是WILLIAM COOLEY医生首次发现。研究发现，感染引起发热的肿瘤患者肿瘤明显消退。从此，热疗开始进入肿瘤的治疗领域［7］。研究发现，热疗作为一种新的肿瘤治疗方法，它与其他方法联合应用，可能比单独在肿瘤中的应用效果更好。大量临床试验证明，温和温度下热疗可以安全地管理患者并取得患者的临床获益，可以明显改善肿瘤的局部控制，缓解症状，甚至提高总体存活率［8］。尽管报道的热疗在癌症的疗效较为满意，但是热疗在临床中还是未被广泛使用，主要有以下原因：机体深部肿瘤的介入方法实施难度大，风险大；热疗过程中的难以维持有效热疗所需的温度；热疗的患者缺乏监测和后勤保障；因此导致热疗未在临床广泛应用的根本原因是热疗的效果和接受度在临床未被广泛认可。

1 传统的热疗方法

目前已有多种热疗的技术在临床上应用，包括电磁辐射（如激光、微波和射频）以及高强度超声聚焦。根据身体的接触热的范围，我们将热疗分为3种类型。全身热疗（whole body HT）、区域热疗（regional HT）以及局部热疗（local HT）。全身热疗主要是通过热水毯子和热室的温度来实现的。而区域热疗包括有肿瘤的灌注患者的部分躯体，通过对患者的肿瘤区域血流温度的升高以及体腔局部温度的升高来达到治疗的目的，如临床上通过腹膜腔的的灌注加热和抗癌药物的局部应用来控制腹膜恶性间皮瘤［9］。但是这些方法对肿瘤特异性不高，在技术上具有挑战性，临床上需要多次加热才能提高治疗效果。

局部热疗方法在临床上应用对肿瘤具有一定的特异性；加热过程中使用定制的探针放置在肿瘤内部或接近肿瘤从而实现对肿瘤的相对均一加热。但是热疗过程中放置在肿瘤外部加热源通常是侵入性的，对较大的肿瘤通常会导致加热不均匀。理想中的热疗方法应该是在肿瘤区域特异性高，微创以及在肿瘤组织中具有较高的热均一性。

2 磁性粒子介导的磁流体热疗

磁流体热疗（magnetici fluid hyperthermia，MFH），就是将磁性纳米粒子通过特定的方式导入到肿瘤内部，然后放置在交变磁场中，磁性粒子在交变磁场的作用下作为致热源产热，从而到达治疗肿瘤的目的。MFH主要包括3个部分：进入到肿瘤区域的磁性纳米粒子的制作；纳米粒子如何导入到肿瘤内部；交变磁场的作用强度和频率［10］。目前磁流体热疗主要有以下3种方式［11］：动脉栓塞热疗（arterial embolization hyperthermia，AEH），磁性纳米粒子通过特定的介入法，经过肿瘤的滋养动脉进入到瘤体内部，进而在交变磁场下发热升温。直接注射热疗（direct injec⁃tion hyperthermia，DIH）将磁性粒子通过直接注射的方法进入肿瘤内的磁热疗方法。细胞内热疗（intracellular hyperthermia，IH），体外对磁性粒子进行对肿瘤具有趋向性的抗原介质的修饰，抗原介质和磁性粒子有效的结合，这些抗原介质将磁性粒子携带至肿瘤内部进行磁热疗的一种方法。由于MFH中的磁性粒子具有分散好、容易到达肿瘤区域的特点，理论上是一种十分理想的肿瘤热疗方法，具有很好的特异性和靶向性。

2.1 磁性纳米粒子研究进展由于MFH是通过磁性粒子的产热来实现的，因此，磁性纳米粒子的形态、结构以及磁饱和度等因素对MFH的实施至关重要。经过长期的研究和探索，目前能够利用当今先进的科学和技术来合成颗粒大小、粒径分布、形状和形态良好的纳米磁性粒子，目前主要有两大主流的合成方法，化学合成和生物合成［12］。

2.1.1 化学合成方法化学合成法在磁性粒子的合成过程中发挥了重要的作用，化学合成的优点是它的多功能性设计和合成新材料，可以完善成最终的产品。主要优点是化学均匀性好，化学合成提供了在分子水平上的混合。目前主流的是化学共沉淀技术，可以从最简单、最有效的化学途径来获取磁性粒子，其主要优势是可以合成大量的纳米磁性粒子。然而粒度分布的控制是有限，因此，此种方法面临的最大挑战是控制粒子的大小以及粒径的分布［13-14］。

另一种常见的方法是水热合成法，在近期的文献中有报道。主要是将铁酸盐通过水热条件水解和氧化或混合金属氢氧化物的中和来实现的，纳米粒子大小的形成与水热的温度有明显的相关性，因此对技术要求较高［15］。

此外，还有其他方法，如多元醇方法，燃烧合成法，溶胶凝胶制备等方法，由于这些方法在化学领域有较多的应用，故不再详细综述［16-17］。化学合成是一种非常有前途的的纳米颗粒合成技术。

2.1.2 生物合成法如上所述，物理化学方法已经成功地应用于生产纳米磁性粒子。然而，这些方法合成的粒子可能有化学毒性。因此与理想中的无毒、粒子分布均匀、均一的特点有一定的差距。

纳米颗粒的生物合成主要有细胞内和细胞外两种途径。趋磁细菌合成是一种重要的细胞内途径方法，此种颗粒组成的单一的纳米晶结构，这些晶体化学结构均匀，拥有一个明确的形态和封闭的蛋白质嵌入脂质双分子层，称为磁小体［18］。其可以有效地嵌合磁性纳米粒子，形成磁性纳米晶体［19］。

2.1.3 磁性纳米粒子的生物相容性磁性粒子在进入实验或临床研究前，一个至关重要的因素就是它的生物相容性。生物相容性好坏直接影响其在未来的药物治疗、接受者的治疗方面的进一步应用研究。理想的生物相容性材料应该具有以下特点：（1）置入到体内的材料能够在体内保持很长一段时间。（2）治疗完成后，这些磁性粒子能够从机体完全清除。因此，决定磁流体热疗的关键因素之一就是磁性粒子的毒性以及磁性粒子表面的涂层材料。

磁性粒子表面的涂层材料的毒性视情况而定，与许多因素有关，包括剂量、化学成分、合成方法、大小、生物降解性、药物动力学、生物分布、表面化学、形状结构等。一般来说，粒子大小、面积、形状、组成和涂层等方面对细胞毒性影响最大，粒子的表面积越大，生物相容性会越差［20］。

2.2 磁流体热疗治疗肿瘤的研究进展磁流体热疗在肿瘤领域取得较快的进展，主要集中在磁性粒子的合成，磁性粒子的特征以及发热能力。近年来，相关的研究进展主要集中在进入临床试验前的相关磁性纳米粒子的细胞毒性，MFH在体内和体外抗肿瘤实验的的相关研究。

2.2.1 体外实验研究体外实验研究主要集中在热介质在磁场的发热性能，肿瘤细胞株和磁场强度等方面的选择。体外实验的结果直接影响体内实验以及进入临床的前期试验研究。为了验证交变磁场对细胞有无影响，学者进行了深入研究。他们将直径为15 nm大小的葡聚糖涂层的Fe3O4磁性粒子与树突状细胞（DC）进行了标记，在交变磁场AMF（f=260千赫，0＜H0＜12.7 kA/m）从5～15 min间隔进行作用，检测磁场是否对树突状细胞有影响。结果证实，一定强度的磁场条件对DC的影响不大，从而说明通过控制磁场强度可以保护正常的组织细胞活性。

研究发现，纳米磁性粒子本身对细胞活性，细胞膜完整性、细胞凋亡和增殖有一定的影响。通过磁性粒子表面的涂层材料可以降低此方面的影响。因此在进入实验和临床前期研究之前，选择合适直径的磁性粒子，有效的粒子表面涂层，对提高生物相容性至关重要［21］。

基于磁性纳米的有效选择，国内外学者进行了体外细胞实验，将Fe3O4纳米磁流体在体外与A549肺癌细胞共培养，在交变磁场下进行了作用。研究证实，Fe3O4在交变磁场的作用下可以升温至42℃以上，能够抑制肺癌A549细胞的增殖，诱导肺癌细胞凋亡，阻滞细胞周期S期。国内学者对胶质瘤、肝癌细胞同样进行了相关研究，结果同样令人振奋［22］。

2.2.2 体内实验研究基于磁流体热疗在体外的成功研究，学者们进行了大量的体内动物实验研究。主要研究方法将磁性粒子通过直接注射热疗和动脉栓塞热疗。RENARD等［28］将超顺磁的铁氧化物 NPs（SPIONs）嵌入在二氧化硅微粒子凝胶中，通过直接的方法注射到乳腺导管癌CB17 SCID小鼠移植瘤中，外加磁场的磁场强度9 660/m、频率144 Hz。结果表明，植入物的物理特性和微观结构可以通过选择一个合适的聚合物和定制的溶剂组合影响来增加加热能力［23］。

研究发现，纳米粒子在体内的生物分布也是影响磁流体热疗的一个重要的方面。GUTIERREZ等［29］将DMSA⁃MNP（300 μg Fe/mL）注入C57BL/6小鼠体内，每周2次，2周后在最后一次注射后1 h将小鼠安乐死。结果发现，只有10%的注入量的在小鼠的组织中被检测到，其余的粒子可能被代谢或经器官排泄出体外。他们的研究结果表明磁性纳米粒子表面的吸附剂改变了其生物分布，从而减少NPs的存在，降低了磁性纳米粒子的毒性［24］。

LEE等［25］研究发现，磁流体中纳米磁性粒子的形状分布对磁场产热也有较大的影响。将不同耦合CoFe2O4@Mn⁃Fe2O4的磁性粒子注射到人脑肿瘤U87MG小鼠移植瘤内部，交流磁场（500 kHz、37.3 kA/m）作用10 min。连续观察18 d，结果发现，核心——壳牌纳米磁性粒子组肿瘤完全消失，而另一组包裹药物（阿霉素）在26 d后再次逐渐长大。进一步进行剂量研究比较核壳纳米粒子的影响，发现磁性粒子剂量为75 mg组的肿瘤完全消除，需要实现相同的结果，阿霉素组需要300 mg的剂量。MARTINEZ⁃BOU⁃BETA等［26］也报道立方颗粒有较大的各向异性，与球形粒子相比，表面各向异性的有益作用提高了加热功率。

此外，纳米磁性粒子的合成方法也会影响细胞毒性以及加热能力［27］。近年来，有学者对新的生物磁性材料——细菌磁小体（bacterial magnetosomes，BMs）进行了研究，证实BMs是一种在磁流体热疗应用中非常有发展前景的热介质材料。将BMs注入到Bal/c小鼠体内，放置在300 kHz的频率和场强度110 Gs交变磁场下作用。结果发现，BMs实验组中所有老鼠活了下来，只有1只小鼠注射BMs后略有不安，但是在4 d后完全恢复。

2.2.3 临床前研究尽管磁性纳米粒子热疗的前期工作有较多的研究，磁性粒子的合成、生物相容性、粒子的毒性以及动物实验有了较快的进展，但是还没有进入临床应用。这可能是由于当前一些技术的限制，如粒子在肿瘤部位特异性差，分布不均匀以及控制热量在肿瘤分布等。在所有研究的粒子中，Fe3O4和γ-Fe2O3已经被用于临床前实验研究，因为这些材料已经被证明显示低毒性及其代谢途径非常明确。为了成功建立磁流体热疗的临床治疗装置，德国的MagForce纳米公司设计了一个交变磁场发生（MFH 300 FTM），这个磁场可以产生100 kHz、0～18 kA/m的磁场强度。它可用于治疗人体任何位置恶性肿瘤［28］。

大多数的临床前试验是在两种肿瘤患者中进行的，即脑部肿瘤和前列腺癌。2003年3月，MAIER HAUFF等［29］进行了第一个临床实验，对14例患有原发性多形性胶质母细胞瘤（GBM）的终末期患者进行治疗。患者入组标准如下：年龄≥18岁；预期寿命＞3个月；肿瘤直径＜5 cm；没有多腔的增长，没有金属材料在肿瘤附近。所有患者接受瘤内注射并接受4～10次的磁流体热疗，每次热疗时间为1 h，结果发现，肿瘤内温度达到42.4℃，患者的治疗耐受性良好。2009年，LANDEGHEM等［30］报道3例患者在研究过程中由于疾病进展而去世，通过尸检发现，磁性粒子分散肿瘤细胞坏死区域，范围局限在注射的范围。2010年，MAIER⁃HAUFF等［31］进行了另一个临床研究，对59例复发胶质母细胞瘤患者进行放疗结合磁流体热疗，这项研究结果同样证明，磁流体热疗结合分次立体定向放射治疗在临床上是有效的，能延长患者总的生存率。

2005年，JOHANSSEN等［32］对一位67岁放疗复发的前列腺癌患者进行试验性治疗，结果发现，在肿瘤内部可以达到有效的温度范围。在随后的一个临床试验中，通过直接注射法对一组复发性前列腺癌患者进行治疗，患者接受每周6次，每次60 min的热疗，磁场强度为4～5 kA/m，结果发现，90%的前列腺区域温度可以升高至38.8～43.4℃，在随后的随访研究中发现，肿瘤区域的磁性粒子在17.5个月仍可检测到，临床观察未见系统性毒性［33］。

到目前为止，这项技术的限制因素是在高频磁场的舒适性差和肿瘤内部不规则热量分布。相比之下，纳米磁性粒子在前列腺区域的沉积持久性较好［34］。如果上述局限性得到解决和克服，那么磁流体热疗就可以安全地和放射治疗相结合，在前列腺癌患者的治疗中将发挥重要的作用。

3 存在的问题及展望

尽管磁流体热疗在恶性肿瘤的治疗中具有很多的潜在发展前景，体外和体内实验结果令人振奋，但是在进入临床治疗中还有很长一段路要走，很多细节工作需要完善。首先是粒子如何精确导入到肿瘤内部的技术问题，目前我们实验研究以及临床前的治疗试验多是经过直接注射的方法来完成的，从而导致粒子在肿瘤内部升温不均匀。尽管有学者通过肿瘤的滋养血管来导入粒子到肿瘤内部，理论上能使粒子在瘤体内均匀分布，但是，实际上对于较大的肿瘤，瘤体内部深处的血管相对贫乏，从而也会导致粒子分布不均，如何解决这一问题，需要更加深入的研究。

第二个存在是问题是纳米粒子质量控制问题。目前我们实验用的纳米粒子合成方法有多种多样，表面包裹不同的涂层，使纳米颗粒的成分越来越复杂。多变的粒子成分会造成粒子直径的测量准确性下降。从而导致粒子的物理测量参数下降。因此，需要制定统一的粒子制作和测量方法。

第三个存在的问题是纳米粒子的生物相容性。纳米粒子的毒性主要有两个方面：一个直接的毒性；另一个是纳米颗粒保留在体内的延迟毒性。直接的毒性可以通过动物实验来检验。目前学者研究的多数铁氧化物纳米磁性粒子，实验证实生物相容性好。但是也有报道其他的磁性纳米颗粒（金、碳纳米管等），仍需要进一步探索期生物相容性。

总之，纳米粒子介导的磁流体热疗作为一种新型的热疗方法，实验研究证实明显优于传统的热疗方法。研究过程中如果解决了纳米粒子的毒性评估，优化粒子性能使其能在瘤体内均匀分布以及有效的沉积在肿瘤内部等问题，有理由相信，它在不久的将来将真正成为肿瘤治疗的绿色方法，造福广大肿瘤患者。

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