非编码RNA调控巨噬细胞极化的研究进展

魏文燕，陈建英

(广东医科大学附属医院，广东湛江 524001)

巨噬细胞按表型和分泌的细胞因子主要分为两种不同的极化类型，即发挥“促炎和杀伤”作用的M1型极化和主导“抗炎和修复”功能的M2型极化。在不同的疾病或炎性微环境中，巨噬细胞不同的极化表型对机体稳态调节有重要意义。近年来巨噬细胞极化受到广泛关注，越来越多的研究发现，非编码RNA可靶向调控巨噬细胞极化通路中的关键蛋白而影响巨噬细胞极化状态，介导多种疾病的发生发展。本文就非编码RNA，如微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA (lncRNA)和环状RNA(circRNA)在调控巨噬细胞极化中的重要作用作一综述。

1 巨噬细胞极化的概述

巨噬细胞是机体免疫的重要组成部分，一方面能够吞噬、杀伤和清除外源性病原微生物和体内损伤、衰老的细胞，在机体天然免疫中发挥重要作用；另一方面可摄取、处理抗原并提呈给T细胞识别，介导特异性免疫应答。巨噬细胞具有较强的可塑性和异质性，在不同因素诱导下，巨噬细胞可分化为行使特定免疫功能的不同细胞亚群。按照其表型和活化状态不同主要分为两种极化类型[1]，即经典激活的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。M1型巨噬细胞呈圆形，可由干扰素-γ(IFN-γ)或脂多糖(LPS)单用或与其他细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)协同诱导，表达主要组织相容性复合体Ⅱ类、CD68、CD80及CD86共刺激分子，可产生多种促炎因子，如TNF-α、IL-12、IL-18、IL-23、IFN-γ、氧自由基和NO等，M1型巨噬细胞既可抵抗病原入侵，也可在特定条件下造成组织损伤。M2型巨噬细胞为纤维细胞样形状，基于不同的刺激，可以进一步分为M2a、M2b和M2c亚群。IL-4或IL-13与相应受体结合可刺激产生高表达CD206的M2a亚型；免疫复合物Toll样受体或IL-1R的激动剂则诱导产生M2b亚型，产生促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎因子IL-10；糖皮质激素和IL-10是触发M2c亚型的主要介质，可释放大量的IL-10和TGF-β。M2型巨噬细胞主要在组织修复与重建、脂类代谢、过敏反应和肿瘤的形成过程中发挥作用。

2 miRNA对巨噬细胞极化的影响

miRNA是天然存在的长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与靶基因mRNA结合，抑制其翻译或使其降解，在转录后水平靶调控基因表达。miRNA可通过调控巨噬细胞极化在感染、肿瘤生长、炎症活化等多种病理过程中发挥重要作用。

2.1 促进M1型巨噬细胞极化的miRNA

2.1.1 miR-27a Yao等[2]研究发现，在细胞和动物水平过表达miR-27a可通过抑制过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)基因表达促进巨噬细胞向M1型极化，降低葡萄糖耐量和胰岛素耐受性，为肥胖症的炎症和胰岛素抵抗提供新的干预靶点。Ma等[3]报道，miR-23a/27a/24-2簇与肿瘤相关巨噬细胞极化密切相关。M1型刺激可以通过促进核转录因-κB(NF-κB)与该基因簇的启动子的结合下调基因簇活性，过表达miR-23a反过来靶向抑制NF-κB通路抑制剂A20进而激活NF-κB通路活性，增加促炎细胞因子的产生。miR-23a和miR-27a可分别通过抑制JAK1/信号转导及转录激活蛋白6和干扰素调节因子4/PPARγ通路减少M2型细胞因子的产生。

2.1.2 miR-223 miR-223是巨噬细胞极化和脂肪组织巨噬细胞介导的肥胖相关组织炎症和胰岛素抵抗的重要调节因子。Ying等[4]发现，miR-223通过靶向抑制 Pknox1 ( PBX /knotted 1 homeobox 1)促进M1型极化，又发现PPARγ可直接增强miR-223的表达，敲除miR-223则削弱PPARγ依赖性M2型巨噬细胞的激活，PPARγ/miR-223调控轴中Rasa1和Nfat5的异位表达可促进巨噬细胞向M2型极化。

2.1.3 let-7d-3p Yan等[5]在研究2型糖尿病小鼠的造血干细胞(HSC)在创伤愈合中的自主机制时发现，HSC氧化应激中的Nox-2依赖性增加可下调let-7d-3p，反过来活化DNA甲基转移酶1，进而增加巨噬细胞极化的关键调节因子Notch1、PU.1和Krüppel样因子4(KLF4)的甲基化水平，KLF4作为PU.1和Notch1 的下游靶基因可诱导M2表型并抑制M1表型。因此，HSC诱导的表观遗传机制减少了伤口处巨噬细胞的募集，抑制M1型巨噬细胞极化。这一机制有可能为2型糖尿病患者伤口愈合提供新策略，降低截肢风险。

2.2 促进M2型巨噬细胞极化的miRNA

2.2.1 miR-181 miR-181家族在心血管炎症、动脉粥样硬化斑块形成中发挥重要作用。de Couto等[6]以心球样细胞(CDC)源外泌体为载体将miR-181b转入巨噬细胞，发现其能减少心梗组织内CD68+巨噬细胞数量，发挥心脏保护作用。众所周知，动脉粥样硬化斑块内大量巨噬细胞浸润易使斑块破裂。急性脑卒中合并动脉粥样硬化斑块患者的血清miR-181b水平降低。An等[7]通过体内外实验研究发现，miR-181b可通过靶向抑制Notch1基因表达，增加M2型巨噬细胞比例，减轻动脉粥样硬化斑块易损性。Sun等[8]则发现，糖尿病肥胖小鼠脂肪组织内皮细胞中miR-181b表达降低，静脉输注miR-181b可使脂肪组织内皮细胞中miR-181b表达增多，进而改善小鼠对胰岛素敏感性和葡萄糖稳态。这种改善作用是通过miR-181b促进胰岛素介导的蛋白激酶B(AKT)磷酸化致使白色脂肪组织中巨噬细胞向M2型极化实现的。同样，Ghorbani等[9]发现，多发性硬化患者的脑白质和自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓中的miR-181a和miR-181b表达降低。过表达miR-181a和miR-181b后其靶基因Smad7被抑制，致使巨噬细胞向M1型极化减弱，减少促炎因子产生，揭示了miR-181a和miR-181b在自身免疫性神经炎症中的抗炎机制。

2.2.2 miR-93 miR-93被证明有利于血管生成并减少遗传性外周动脉疾病组织缺失，但其介导的缺血肌肉血管再生所涉及的信号传导及下游机制不明。Ganta等[10]最新研究发现，与野生型小鼠相比，miR106b-93-25-/-小鼠血管生成和动脉生成减少，M1型巨噬细胞增多。在该基因敲除小鼠肌肉内过表达miR93后血管生成、动脉生成和灌注均增加，肌肉组织中M2型巨噬细胞增多。进一步RNA测序分析和萤光素酶报告结果表明，miR-93通过抑制干扰素调节因子9减少免疫反应性基因-1和衣康酸表达，从而在缺血肌肉中诱导M2型巨噬细胞极化，促进血管生成、动脉生成和灌注恢复。

2.2.3 miR-1246 TP53基因(编码p53蛋白)突变是人类癌症中最常见的遗传改变之一，突变的TP53基因(mutp53)可消除p53介导的抑癌作用。Cooks等[11]研究报道，mutp53癌细胞可通过核外通信物质重编程巨噬细胞。研究者发现，与mutp53敲低或敲除相比，携带mutp53的M0和M2型巨噬细胞IL-10、趋化因子CCL2和血管内皮生长因子表达增加，TNF-α表达减少。进一步蛋白组学分析显示，mutp53肿瘤细胞重编程的巨噬细胞中促炎因子IL-8、IFN-γ、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平下降，CD206和CD163表达增加；质谱分析显示，巨噬细胞与mutp53肿瘤细胞共培养的分泌物中促肿瘤发生因子分泌增加，如基质金属肽酶9、血管非炎性分子1和TNF-β诱导基因；并发现mutp53肿瘤细胞分泌的外泌体富含miR-1246等miRs，转染miR-1246的M2型巨噬细胞与mutp53肿瘤细胞共注射免疫缺陷小鼠后，肿瘤体积增大、癌细胞发生转移。随后，研究者选取43例结直肠癌患者进一步验证了miR-1246与mutp53的关联性及它们在肿瘤发生发展中的作用。由此可见，mutp53肿瘤细胞释放的富含miR-1246的外泌体被邻近的巨噬细胞内化，促使巨噬细胞重编程为M2表型，发挥抗炎和促进肿瘤发展作用。该研究对结肠癌的诊断和治疗有一定的指导意义，然而，外泌体内其他组分是否也能发挥作用及miR-1246的作用机制还有待进一步研究。

2.2.4 miR-26a Sahu等[12]在感染结核分枝杆菌(MTb)的巨噬细胞和结核患者的外周血中均观察到miR-26a表达下降，其靶基因KLF4水平增高，后者通过CREB-C/EBPβ信号轴发挥促M2极化的作用。Ahluwalia等[13]利用生物信息学分析发现，miR-155、miR-33、miR-27a和miR-27b在促M2型巨噬细胞极化中发挥重要作用，进而调控巨噬细胞中MTb的生存。

此外，Hsu等[14]发现，肺癌患者血清及低氧诱导的肺癌细胞衍生的细胞外囊泡(EV)富含miR-103a。巨噬细胞转染miR-103a可靶向抑制抑癌基因磷酸酶及张力蛋白同源物表达，进而激活AKT、信号传导及转录激活因子3、免疫抑制因子和促血管生成因子的表达。相反，miR-103a抑制剂可减少低氧介导的M2型极化。外泌体中的ncRNAs在肿瘤免疫治疗中的研究是继外泌体热之后的又一新兴热点，对临床治疗有很大的启发。

Baer等[15]条件性敲除miRNA加工酶Dicer(即核糖核酸内切酶)后发现活化的IFN-γ/STAT1信号将肿瘤相关巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞。Guerriero等[16]则利用Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶抑制剂TMP195治疗巨噬细胞依赖性原发性乳腺癌小鼠，证明其可通过调节巨噬细胞表型改变肿瘤微环境，从而发挥巨噬细胞的抗肿瘤潜能并减少肺转移。这些研究利用表观遗传学工具重编程巨噬细胞表型有可能为癌症治疗提供新的手段。

3 LncRNA对巨噬细胞极化的影响

LncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，参与多种病理生理过程，包括胚胎发育、表观遗传调控、肿瘤转移、细胞分化和细胞周期调控等，是遗传学的研究热点。已有研究报道，LncRNA在不同疾病过程中具有关键功能，近年越来越多的研究显示，LncRNA可调节免疫系统。

巨噬细胞与糖尿病并发症中炎症相关机制是研究热点。研究表明，糖尿病可通过调节与巨噬细胞功能相关的转录因子影响巨噬细胞表型。Reddy等[17]首次揭示，LncRNA在糖尿病巨噬细胞中存在差异表达，其中LncRNA E330013P06在2型糖尿病患者的单核细胞及胰岛素抵抗2型糖尿病小鼠的巨噬细胞中均显著上调，而1型糖尿病小鼠则没有，这说明E330013P06依赖的机制只适用于2型糖尿病。高糖和棕榈酸处理的小鼠巨噬细胞中，E330013P06随着炎症基因表达而增加。过表达E330013P06促进炎性基因表达，增强对炎症信号的应答及泡沫细胞形成。相反，沉默E330013P06抑制糖尿病诱导的炎性基因表达。这些结果证明LncRNA通过调节巨噬细胞极化治疗炎性糖尿病并发症的可能性。

此外，巨噬细胞引起的炎症级联反应是种植体周围骨溶解的病理生理机制之一。已有研究报道，促进M2型巨噬细胞极化可缓解与磨损颗粒相关的种植体周围骨溶解。Gao等[18]首次报道，KCNQ1OT1可靶向抑制miR-21a-5p，上调IL-10表达、逆转聚甲基丙烯酸甲酯诱导的M1型巨噬细胞极化，促进巨噬细胞向M2型极化，减轻颗粒诱导的骨质溶解。

Du等[19]研究显示，LPS诱导的LncRNA Mirt2可阻遏炎症的异常激活，是巨噬细胞极化的潜在调节因子。LPS可通过TLR4信号激活依赖E3泛素连接酶(TRAF6)的促炎信号途径，LncRNA Mirt2可靶向TRAF6降低Lys63(K63)的泛素化水平进而抑制NF-κB和MAPK的活化及促炎因子的产生。异位表达Mirt2的巨噬细胞受到IL-4刺激后M2型表面标记分子精氨酸酶-1、CD206、Fizz1、Ym1和CCL24水平迅速增加，而TNF、IL-1β、IL-6和IL-12等M1型表面标记分子被抑制。

Sun等[20]亦发现，LncRNA GAS5为小胶质细胞极化的表观遗传调节物。功能学研究表明，GAS5通过招募多梳抑制复合物2抑制M2型巨噬细胞极化的关键因子TRF4的转录，从而抑制小胶质细胞向M2型极化。因此，GAS5有望成为脱髓鞘疾病的治疗靶点。另有研究[21]显示，用LPS和固定化IgG(免疫复合物，IC)刺激骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)极化为M2b表型后GAS5 RNA水平降低，在CpG DNA(一个典型的M1型诱导物)刺激并转染GAS5后巨噬细胞向M1型极化。进一步研究证实，活化无义介导的RNA衰变途径下调GAS5 RNA表达可促进BMDM极化为M2b型巨噬细胞，但其具体调节机制尚未明晰。M2b巨噬细胞极化是增加某些患者对肠道细菌相关性脓毒症易感性的原因，因此，GAS5基因转导可能成为控制这些感染的新策略。

Huang等[22]则对人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞和THP-1细胞中LncRNAs进行高通量测序后，发现TCONS_00019715在M1型巨噬细胞中表达增高，当M1型转化为M2型时TCONS_00019715表达降低；在IFN-γ和LPS刺激的THP-1细胞中敲低TCONS_00019715后M1型表面标记表达降低，M2型表面标记表达升高；进一步研究发现，敲低TCONS_00019715后调控巨噬细胞极化的关键基因PAK1表达降低。这些数据表明TCONS_00019715可能在促进M1型巨噬细胞极化方面发挥重要作用，PAK1可能与之密切相关。

LncRNA cox-2在Pam3CSK4、LPS或R848处理的巨噬细胞中以MyD88-和NF-κB依赖性方式产生。已有研究表明，LncRNA cox-2通过促进M1型极化和抑制M2型极化来抑制肝癌细胞的免疫逃逸、侵袭和迁移。Ye等[23]发现，M1型巨噬细胞高表达LncRNA cox-2，沉默LncRNA cox-2后IL-12、iNOS和TNF-α表达水平降低；相反，IL-10、精氨酸酶-1和Fizz-1表达增加。巨噬细胞与肝癌细胞株共培养发现，沉默cox2可逆转M1型巨噬细胞对肝癌细胞的生长活性、集落形成、侵袭和迁移的抑制作用，并增强M2型巨噬细胞对上述肝癌细胞生物学过程的促进作用。

众多研究表明，间充质干细胞(MSCs)在免疫调控中发挥重要作用。Li等[24]发现，严重子痫前期患者的脐带组织和MSCs中LncRNA MALAT1表达降低，过表达MALAT1后MSCs可通过分泌更多的IDO促进巨噬细胞向M2型极化，进而增强MSCs在体内的免疫抑制作用。MALAT1作为MSCs的内源调节因子，可能在先兆子痫中发挥免疫抑制作用。

基因间转录超保守RNAs(T-UCRs)作为一种特殊的LncRNA类型，可调控小鼠、大鼠和人类严格保守的mRNA的表达和翻译。鉴于巨噬细胞及T-UCRs在肿瘤中的重要作用，Luo等[25]观察到M2型向M1型极化的U937细胞中有2 977个差异表达的T-UCRs，且在30例假手术组和252例病例组中发现，巨噬细胞来源的uc.306在富含M1型巨噬细胞(CD68+)的肝癌癌旁正常组织中高表达，在以M2型巨噬细胞(CD163+)为主的肝癌组织中低表达，且uc.306通过BTRC(β-TrCP)-Wnt信号通路影响HBV相关肝癌的进展。该发现可能为肝癌诊断和治疗提供新的分子标志物。

4 circRNA与巨噬细胞极化

circRNA是一类由单个RNA分子通过末端共价连接形成的一类特殊的非编码RNA，是RNA领域最新的研究热点。circRNA在人体细胞中广泛表达，可通过调控巨噬细胞极化在炎症相关疾病进程中发挥重要作用。

Zhang等[26]通过芯片分析比较两种不同极化状态(IFN-γ和LPS刺激诱导的M1型巨噬细胞及IL-4诱导的M2型巨噬细胞)下BMDM中circRNA表达谱变化，发现共有189个circRNAs在M1型和M2型巨噬细胞之间存在差异表达(与M2相比，M1中有62个circRNAs上调，127个circRNAs下调)。进一步通过RT-PCR验证发现，M1型中circRNA-003780、circRNA-010056及circRNA-010231表达上调，circRNA-003424、circRNA-013630、circRNA-001489和circRNA-018127显著下调，与芯片分析结果一致。随后生物信息学预测显示，M1型中高表达的circRNA-010231与miR-141-5p、miR-145a-5p、miR-1964-5p、miR-19b-2-5p、miR-6950-5p可能存在相互作用。这项分析有助于了解在不同刺激条件下circRNA在调控巨噬细胞极化中的作用。circRNA/miRNA之间的交互作用在调控巨噬细胞极化的相关机制可能成为未来研究热点。

有研究发现，circHECTD1和circZC3H4 RNA可通过影响巨噬细胞活化调节矽肺的炎症级联反应。矽肺患者肺组织中HECTD1、锌指CCCH型蛋白ZC3H4均与巨噬细胞标志物F4/80存在共定位。在SiO2诱导的肺泡巨噬细胞中发现，circHECTD1表达减少，HECTD1蛋白水平则与NOS2、ARG和SOCS3水平呈时间依赖性增加。HECTD1通过泛素-蛋白酶体系统降解ZC3H12A，从而下调IL-1β、IL-6、IL-12p40 mRNA水平，circHECTD1/HECTD1和ZC3H12A之间的相互作用使M1/M2失衡，从而促M2型巨噬细胞产生大量促纤维化细胞因子，导致肺组织进行性纤维化的发生。相反，circZC3H4 RNA与ZC3H4在SiO2诱导的肺泡巨噬细胞中表达增多。miR-212可抑制ZC3H4蛋白表达，circZC3H4 RNA则通过与miR-212碱基互补配对结合调节其活性，因此，沉默circZC3H4 RNA则逆转其效应。由此可见，HECTD1和ZC3H4可能成为矽肺的潜在标志物。

另有研究发现，敲低mcircRasGEF1B可减少LPS诱导的ICAM-1表达，已有报道ICAM-1可以抑制肿瘤微环境中M2型巨噬细胞极化。可以猜测，mcircRasGEF1B的低表达可能导致TAM转向M2表型，即circRasGEF1B通过调节成熟ICAM-1 mRNA的稳定性来正向调节ICAM-1的表达，这是一种有别于经典“海绵作用”的新机制，有待进一步研究。

5 小结与展望

除以上三类非编码RNA外，其他类型的非编码RNA也有可能在调控巨噬细胞极化中发挥重要作用，如Y RNAs是EVs中丰富存在的非编码RNA。CDC源性外泌体中富含的Y RNA片段可增加IL-10分泌、减少促炎细胞因子释放，减小心肌梗死面积，从而增强CDC对心脏的保护作用。

尽管过去几十年取得了很大的进展，但与巨噬细胞极化有关的更多可能机制有待发现，巨噬细胞极化对生理功能和病理变化的影响尚有很大的研究空间。巨噬细胞的异质性和可塑性使巨噬细胞与微环境之间的相互作用成为一个复杂而动态的过程，目前对这种相互作用的了解有限。不过，包括单细胞分析和计算生物学方法在内的新技术的应用将更好地促进这一领域的发展，并有望实现更大的突破，如发现新的治疗靶点，从而实现科学研究到临床应用的转化。