强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞、血清SPARC表达变化及意义

王丽亚，杨清锐(菏泽医学专科学校，山东菏泽74000；山东大学附属省立医院)

强直性脊柱炎(AS)是一种以慢性炎症为主的全身性疾病，主要累及骶髂关节和脊柱中轴关节[1]。富含半胱氨酸酸性分泌蛋白(SPARC)是Termine等[2]在1981年于牛骨中初步鉴定的一种非胶原成分，是一种富含半胱氨酸的小分子糖蛋白，也被称作骨连接蛋白、基底膜40蛋白(BM40)。SPARC作为一种可由许多细胞分泌的非结构性细胞外间质蛋白，与骨形成、伤口愈合、血管生成和胚胎发育等均存在密切关系[3]。SPARC可调节细胞外基质(ECM)分泌，影响树突状细胞迁移和T细胞启动抗原特异性免疫反应，增加转化生长因子β(TGF-β)活性，进而抑制免疫炎症反应[4,5]。Sharma等[6]首先发现，SPRAC是引起脊柱关节病的固有免疫系统的组成部分。但目前尚缺乏SPARC与AS关系的相关研究。本研究观察AS患者外周血单个核细胞、血清SPARC表达变化，并探讨其在AS病情进展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年12月～2016年11月山东大学附属省立医院风湿免疫科收治的AS患者70例作为观察组，男66例、女4例，年龄(33.36±9.39)岁，病程(8.23±6.57)年。患者均符合1984年修订的纽约AS诊断标准[10]，排除其他自身免疫性疾病、肝脏和肾脏疾病、感染、恶性肿瘤和血管疾病等。选择同期体检健康志愿者70例作为对照组，男60例、女10例，年龄(31.01±8.27)岁。两组性别构成比、年龄具有可比性。本研究通过山东大学附属省立医院医学伦理委员会审核，受试者及家属均签署知情同意书。

1.2 外周血单个核细胞分离及SPARC mRNA表达检测 收集两组空腹肘静脉血3 mL，采用Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞，从界面收集细胞，Hank液洗涤3次。加入细胞裂解液，采用TRIzol法提取外周血单个核细胞中的总RNA，逆转录合成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，SPARC上游引物：5′-TCGCCTGAGGCTGTAACTGA-3′，下游引物：5′-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3′，引物长度：406 bp；内参β-actin 上游引物：5′-GGCTACAGCTTCAC-CACCAC-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTG-GAAGAG-3′，引物长度：212 bp。采用Roche480实时荧光定量PCR系统进行PCR反应。PCR反应体系：上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR Green 10 μL，DEPC 7.2 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共39个循环；72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法计算SPARC mRNA相对表达量。

1.3 血清SPARC表达检测 采用ELISA法。收集两组空腹肘静脉血3 mL于含有血清分离胶的无菌促凝试管中。静置半小时后采用离心机1 000 r/min离心20 min，取上层血清，- 80 ℃冰箱保存。采用抗人SPARC ELISA试剂盒检测血清SPARC蛋白表达，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 观察组外周血单个核细胞、血清SPARC表达与病情相关指标的相关性分析 记录观察组Bath强直性脊柱炎疾病活动指数(BASDAI)，并检测其血细胞沉降率(ESR)及CRP。BASDAI包括疲劳、脊柱痛、外周关节痛、局限性压痛以及晨僵持续时间和程度共6个项目，每个项目10分，6个项目总分除以5即为BASDAI。抽取观察组晨起空腹肘静脉血，采用魏式法检测ESR，免疫比浊法检测CRP。采用Spearman相关分析法分析观察组外周血单个核细胞、血清SPARC表达与BASDAI、ESR、CRP的关系。

2 结果

2.1 两组外周血单个核细胞、血清SPARC表达比较 观察组外周血单个核细胞中SPARC mRNA相对表达量为22.706±2.704，对照组为24.035±2.590，两组比较P<0.01。观察组血清SPARC表达为(1 287.690±486.101)ng/dL，对照组为(1 490.530±503.459)ng/dL，两组比较P<0.01。

2.2 观察组外周血单个核细胞SPARC表达与BASDAI、ESR、CRP的关系 观察组BASDAI为(4.76±1.48)分，ESR为(31.39±18.02)mm/h，CRP为(28.53±15.70)mg/L。观察组外周血单个核细胞SPARC表达与BASDAI、ESR、CRP均呈负相关关系(r分别为- 0.372、- 0.362、- 0.399，P均<0.01)。

2.3 观察组血清SPARC表达与BASDAI、ESR、CRP的关系 观察组血清SPARC表达与BASDAI、ESR、CRP均呈负相关关系(r分别为- 0.285、- 0.332、- 0.560，P<0.05或<0.01)。

3 讨论

SPARC是一种能结合细胞外基质中糖和胶原等物质的特殊型分泌性糖蛋白，其本身并不参与细胞外结构组成，而是通过与细胞膜受体、蛋白酶和生长因子等相互作用，调节细胞外基质成分、细胞形态和黏附性，从而发挥多种生物学活性[7，8，11]。目前发现，SPARC能够抑制细胞周期、调节细胞分化、抑制某些细胞因子生成；可参与机体炎症反应、血管生成、伤口愈合、肿瘤迁移等生理病理过程，参与多种疾病的发生与发展[3,6]。研究发现，SAPRC基因纯合子突变与成骨不全症密切相关，可导致人类发生严重的骨质疏松[12]；成骨障碍患者的成骨细胞中SPARC表达明显减低[13]。Zhao等[14]发现，SPARC基因敲除小鼠较野生型小鼠骨密度明显降低，并且小梁骨骨量丢失更快，说明SPARC是影响骨细胞分化和成骨细胞活性的重要因子。

研究证实，免疫炎症性反应在AS的发生、发展过程中具有重要作用。TNF-α是公认的参与AS发病的促炎因子之一[15]，其不仅直接参与关节滑膜组织炎症反应，也可促进破骨细胞的溶骨作用，增加骨吸收，促进成纤维细胞增生，造成关节破坏及关节强直[16]。研究表明，SPARC与TGF-β相互作用，可抑制TNF-α产生，进而减轻体内炎症反应并促进成骨细胞增殖和分化[7]。本研究结果显示，观察组外周血单个核细胞、血清SPARC表达均明显低于对照组，且均与疾病活动指标BASDAI、ESR及CRP呈负相关关系，提示SPARC可抑制AS患者体内的炎症反应，在一定程度上与疾病活动密切相关。许敬人等[16]发现，提高AS伴骨质疏松患者血清SPARC水平有助于减轻其免疫炎症反应，同时可改善脊柱、关节活动功能，增加骨生成，减少骨吸收，最终提高骨密度。

综上所述，AS患者外周血单个核细胞、血清SPARC表达均降低，SPARC表达检测有助于判断患者病情活动，但其具体作用机制尚需进一步研究证实。

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