烟曲霉菌与支气管哮喘关系的研究进展

袁晓芳，王宋平

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，是一种普遍的呼吸系统疾病，其发作对患者生活质量及社会经济负担有显著的影响[1]。哮喘发作的原因包括接触非特异性变应原与特异性变应原,其中特异性变应原包括尘螨、花粉、真菌、动物毛屑等。烟曲霉菌是日常生活中最常见的空气传播真菌病原体，是人类哮喘病常见的气体中的过敏原[2]。随着变态反应性支气管肺曲霉病、变态反应性支气管肺霉菌病、真菌致敏性重症哮喘等概念的提出，烟曲霉菌与哮喘的关系越来越受到重视。无数烟曲霉菌的孢子被人类和动物不断吸入，在生长过程中释放多种蛋白酶诱发哮喘急性发作；且其体积很小，极易进入呼吸道并定植于气道。研究[3]表明，环境中的大量烟曲霉菌孢子吸入与哮喘的急性发作及病情加重有密切关系。现就烟曲霉菌与哮喘关系的研究进展作一综述。

1　烟曲霉菌与哮喘发病原因

烟曲霉菌是广泛存在于室内外的一种过敏原，被易感个体吸入后易诱发哮喘急性发作，慢性烟曲霉菌暴露的哮喘患者病情恶化加重的风险也大大增加。早在20世纪，Weiss等[4]收集了1982～1986年美国哮喘患者住院及死亡资料，发现5～34岁哮喘患者中因哮喘发作而死亡的死亡高峰在6～8月，而这个时间段也是烟曲霉菌孢子的生长高峰期；而相似的情况也被其他学者所发现，表明烟曲霉菌与哮喘发病有着密切关系。Denning等[5]通过实验指出，持续的烟曲霉菌暴露是哮喘加重的诱因，并且通过对哮喘患者气道内定植菌检测发现，曲霉菌广泛存在于哮喘患者的支气管肺组织内。Fair等[6]研究了58例成年患者(这些患者经英国格伦菲尔德医院明确诊断为哮喘)来表明哮喘与烟曲霉菌的关系。这些学者在2007年8月～2010年11月随访收集了哮喘患者痰标本及这些哮喘患者起居室中的空气样本，发现那些痰培养为烟曲霉菌阳性的哮喘患者与痰培养阴性的患者相比，起居室的空气中存在着更高水平的烟曲霉菌孢子。这是首个显示室内空气真菌孢子浓度与痰中检测浓度直接相关的研究，同时该研究也表明了哮喘患者气道中存在烟曲霉菌的定植。Maurya等[7]对105例哮喘患者和26例志愿者进行曲霉菌属的空气变应原、抗曲霉抗原的血清沉淀、抗烟曲霉病的特异性IgG、总血清IgE水平和常规血液及血清放射学检查等，发现28.5%的哮喘患者对烟曲霉菌抗原皮肤测试表现出阳性反应，10.4%的哮喘患者对抗烟曲霉病的特异性IgG有特异性反应，7.6%的哮喘患者对抗曲霉抗原的血清沉淀有阳性反应，而志愿者中没有对曲霉抗原敏感，认为烟曲霉菌是重症哮喘的独立危险因素。

几十年来，真菌被认为与哮喘和其他反应性气道疾病的发生有关。在真菌中，烟曲霉菌的暴露、感染、定植是严重的肺过敏性疾病最常见的原因[8]。文献报道，全球有数百万的易感个体因烟曲霉菌及空气中的其他真菌颗粒而发生肺部及鼻部过敏，严重的哮喘与真菌过敏及烟曲霉菌定植(或感染)气道有关，而这一情况不仅仅发生在成年人，同时也发生于儿童[5,9]。Malo等[10]早在1979年就对北美的200例哮喘患者用烟曲霉菌提取物(这些烟曲霉菌提取物被证实对50例过敏性曲霉菌患者能产生阳性反应)进行了皮肤试验，发现21.5%通过点刺激试验对提取物做出反应，39%通过皮内试验做出反应，表明部分哮喘与烟曲霉菌致敏有关。最近的流行病学研究显示，烟曲霉菌致敏与哮喘病情恶化加重之间存在密切关系，并且烟曲霉菌感染增加了哮喘发病率与病死率。据统计，因真菌致敏而引起的重症哮喘影响着全球325万～1 300万的成年人，并且每年约10万人死于真菌致敏的哮喘[11]。

2　 烟曲霉菌与哮喘发病机制

2.1气道上皮损伤及气道重塑气道上皮细胞损伤脱落是哮喘的重要病理特征；在损伤的上皮下方，可见纤维母细胞、平滑肌细胞增生，以及间质胶原异常沉积等气道重塑的表现。国内外均有实验表明，烟曲霉菌可导致不同程度的气道上皮受损及气道重塑。Hogaboam等[12]通过鼻内滴注烟曲霉菌制造真菌致敏性哮喘小鼠模型，发现经烟曲霉菌暴露的小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中干扰素γ(INF-γ)、转化生长因子β(TGF-β)显著升高，支气管气道杯状细胞、纤维细胞增生，气道羟脯氨酸表达增高。Samarainghe等[2]在比较气管内予以烟曲霉菌分生孢子及空气吸入两种方式所致的真菌致敏性哮喘对小鼠气道影响差别的实验中发现，两组小鼠在烟曲霉菌影响下均出现气道上皮下纤维化、胶原沉积和平滑肌细胞增生的情况。Amitani等[13]在实验中证明，烟曲霉菌可产生多种生物活性物质减慢支气管纤毛摆动并造成气道上皮细胞的损伤，且支气管纤毛摆动减慢及损伤的气道上皮有利于烟曲霉菌定植于气道。Blease等[14]提出烟曲霉菌的孢子对致敏的个体不仅造成IgE、辅助性T细胞2型(Th2)因子、C-C趋化因子增高，还存在上皮下纤维化和杯状细胞增生等上皮损伤表现。有研究用烟曲霉菌攻击趋化因子受体1(CCR1)野生型和CCR1敲除的两组小鼠，发现两组小鼠均存在气道高反应性，但CCR1敲除组小鼠IL-4、IL-13和Th2诱导的趋化因子如C10、巨噬细胞衍生的趋化因子、大气道周围杯状细胞及上皮下纤维化较CCR1野生型组明显减少，CCR1敲除组气道重塑情况较CCR1野生型减轻，并提出CCR1可能是烟曲霉菌致敏哮喘气道重塑的重要受体。王妍[15]使哮喘大鼠在雾化激发前接触烟曲霉菌孢子，测定BALF中总蛋白浓度以观察支气管上皮损伤情况，测定跨肺压和气体流速计算激发后气道反应性；结果发现，接触烟曲霉菌使BALF中总蛋白浓度升高，烟曲霉菌暴露能加重大鼠气道上皮的损伤并且增加气道反应性。本实验同时测定肺组织中的Toll样受体2(TLR2)mRNA，发现雾化吸入前接触烟曲霉菌孢子的哮喘大鼠肺组织中TLR2 mRNA表达上调更多，推测TLR2可能加重了烟曲霉菌孢子暴露后哮喘大鼠支气管上皮损伤。

2.2气道炎症及免疫因素哮喘气道上皮下有多种炎性细胞的浸润，慢性气道炎症是哮喘的基本特征。在哮喘的急性发作过程中，过敏原经过抗原提呈细胞激活Th2细胞，活化的Th2细胞释放细胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等；这些细胞因子促进嗜酸性粒细胞生长、迁移和活化、分化，刺激激活B淋巴细胞合成特异性IgE与多种细胞表面受体结合；当过敏原再次入侵人体，多种效应细胞释放相关活性介质，诱发哮喘。烟曲霉菌不仅能刺激炎性细胞释放细胞因子，还能增强气道高反应性，引起哮喘急性发作。Samarainghe等[2]将烟曲霉菌分生孢子以滴入及吸入两种方式暴露于哮喘小鼠气道，两组小鼠气道中均发现大量巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞聚集，并检测到大量IgE的释放。Hogaboam等[12]也发现，烟曲霉菌致敏哮喘小鼠BALF中存在大量嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，且烟曲霉菌暴露后小鼠气道出现显著增强的高反应性，且这种气道高反应性持续30 d仍存在。Tomee等[16]发现,烟曲霉菌中的蛋白酶可诱导促炎性细胞因子如IL-8和IL-6以及单核细胞趋化蛋白1的释放，并导致气道上皮细胞脱落,引起细胞凋亡。Blease等[17]发现，烟曲霉菌可引起致敏小鼠分泌大量IL-13、IL-4及IL-14。Haczku等[18]对小鼠采取鼻后滴注的方式将烟曲霉菌暴露于气道，用酶联免疫吸附法测定小鼠血清免疫球蛋白，发现小鼠血清总IgE以及烟曲霉菌的特异性IgE、IgG1显著增高，同时还发现血清免疫球蛋白的升高与气道嗜酸性粒细胞增多以及IL-4、IL-5分泌增多有关；这些经烟曲霉菌暴露后的小鼠不仅表现出炎性细胞因子及炎性细胞的释放增多，还表现出对乙酰胆碱的反应性高度增加。汪泽等[19]对慢性哮喘大鼠气道反复暴露烟曲霉菌孢子后，测定BALF中炎性细胞及嗜酸性粒细胞数以及IL-13、IL-15、总IgE表达量，发现慢性烟曲霉菌暴露会增加哮喘大鼠气道炎性细胞浸润及细胞因子的释放。郑明睿[20]建立哮喘模型大鼠，使其反复雾化吸入烟曲霉菌孢子，再检测肺组织中炎性细胞及细胞因子数量，同样发现慢性烟曲霉菌暴露会增加哮喘大鼠气道炎性细胞浸润及细胞因子的释放。龙飞[21]将暴露于烟曲霉菌孢子中的大鼠与正常大鼠比较，发现暴露于烟曲霉菌大鼠BALF上清液中黏液蛋白5ac(Muc5ac)和粒-巨细胞刺激因子(GM-CSF)明显增高，且大鼠气道对乙酰胆碱反应性明显增高；并认为烟曲霉菌可能通过促进Muc5ac、GM-CSF释放及增加气道高反应性引起大鼠哮喘发生并加重哮喘大鼠病情发展。而张志红[22]在A549细胞的体外实验中发现，该细胞与各种刺激因子共同培养后可产生大量IL-6、IL-8,且酵母菌多聚糖能诱导该细胞释放IL-6及IL-8显著增多,而烟曲霉菌菌丝片段仅能刺激该细胞产生有限的同样细胞因子。因此，其认为烟曲霉菌孢子可能通过抑制气道上皮细胞释放炎性因子，导致炎性细胞包括吞噬细胞向局部炎症部位趋化减弱，逃避吞噬从而在肺内长期生存，再通过芽生释放过敏原引起哮喘发作。这些研究均表明烟曲霉菌可通过气道炎症及免疫因素诱发及加重哮喘。

3　烟曲霉菌与哮喘治疗

糖皮质激素是治疗哮喘的一线抗炎药物，其通过与糖皮质激素受体(GCR)结合而发挥抗炎作用；部分对激素治疗效果不佳的哮喘称为激素抵抗型哮喘。而对于烟曲霉菌致敏哮喘及慢性烟曲霉菌暴露的哮喘患者，激素治疗效果及抗真菌治疗效果如何，国内外有大量的相关实验。周霞等[23]用烟曲霉菌致敏制造哮喘模型，通过测量大鼠肺组织中GCR mRNA和蛋白含量，发现烟曲霉暴露可降低哮喘大鼠肺组织GCR的表达。周霞等[24]的另一项实验用地塞米松干预烟曲霉菌暴露大鼠，通过酶联免疫吸附法及RT-PCR检测肺组织中IL-33的表达情况，并将肺组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中观察烟曲霉菌菌落生长情况；结果发现地塞米松可降低烟曲霉菌哮喘大鼠IL-33的表达，但培养基中烟曲霉菌菌落明显生长，表明地塞米松有降低细胞因子的作用，但增加了气道真菌定植的风险。郑明睿[20]也在实验中发现，烟曲霉菌孢子吸入能诱导大鼠肺组织内GCR表达下降。烟曲霉菌致敏及慢性烟曲霉菌暴露可能导致其GCR表达下降，从而使该类哮喘患者对糖皮质激素的治疗不敏感。因此，烟曲霉菌感染可能是激素抵抗型哮喘的原因之一。

对于烟曲霉菌有关的哮喘患者抗真菌治疗疗效，目前国内外均有不同说法。Denning等[25]招募58例重症哮喘患者(这些患者通过检测伴有真菌感染且大多数为烟曲霉菌感染，不伴有过敏性支气管肺曲霉菌病)，让患者随机口服伊曲康唑(200 mg，2次/d)或口服安慰剂32周；随访16周，发现口服抗真菌药物对真菌致敏哮喘有较好的治疗效果，其中大约60%的患者生活质量有了很大的改善。Chishimba等[26]认为，伊曲康唑对真菌致敏性哮喘患者在治疗中存在40%失败率和不良事件，而采用回顾性分析方法评估二线、三线抗真菌药物伏立康唑或泊沙对真菌致敏性哮喘患者(大部分为烟曲霉菌致敏)生活质量的影响，发现该两种药可能改善哮喘控制并降低严重程度。李琳等[27]收集了2006～2011年上海市第一人民医院符合真菌致敏严重哮喘的15例患者在口服伊曲康唑治疗至少1个月后的肺功能、外周血嗜酸性粒细胞数等指标，发现完成6个月及以上治疗疗程的患者第1秒用力呼气容积、呼气峰流速有所增加，外周血嗜酸性粒细胞数及口服激素剂量均有降低，认为伊曲康唑治疗真菌致敏性哮喘有较好的疗效。然而Agbetile等[28]将65例烟曲霉菌致敏的哮喘患者(这些患者在过去1年中至少2次出现哮喘加重)随机分配，其中32例服用伏立康唑(200 mg，2次/d)，27例接受安慰剂治疗，持续治疗3个月，随访9个月观察两组人群生活质量的改善情况，认为口服伏立康唑对烟曲霉菌致敏的中到重度哮喘患者未表现出明显的有益效果。

由于烟曲霉菌相关性哮喘抗真菌药物使用疗程长、不良作用大且疗效不确定，国内外对于烟曲霉菌感染的致病机制均有研究，并致力于通过多种实验寻找新的治疗靶点。马宁[29]发现，烟曲霉菌可活化CD4+T细胞，该细胞活化所导致的miRNA-142-3P下调可明显上调rictor的表达，最终通过增强INF-γ的分泌来增强抵抗烟曲霉菌的感染，提示miRNA-142-3P可能为烟曲霉菌感染提供一种新治疗靶点和思路。Blease等[17]研究表明，对IL-13采取免疫中和治疗在延长慢性哮喘诱发的时间点方面有显著疗效，且这种IL-13的免疫中和治疗效果在停止治疗后没有被扭转，故认为抗IL-13为烟曲霉菌致敏性哮喘治疗提供了有吸引力的方法。虽然这些发现目前未在临床上得到应用，但为烟曲霉菌致敏性哮喘、慢性烟曲霉菌暴露、烟曲霉菌长期定植于气道上皮哮喘患者的治疗提供了新的治疗思路。

烟曲霉菌是空气中广泛存在的一种真菌，是哮喘重要的过敏原，它的存在与哮喘的急性发作、恶化加重甚至哮喘患者的死亡有着极大的关系。与其他过敏原所致哮喘相比，烟曲霉菌致敏性哮喘不仅能引起Th2细胞释放大量的细胞因子，使巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞聚集，引起大量IgE的释放，导致气道上皮损伤、气道重塑；其还存在抑制气道上皮细胞释放炎症因子，逃避巨噬细胞的吞噬作用而长期定植于气道上皮，导致哮喘的慢性化的特点。对于慢性哮喘患者，反复的烟曲霉菌暴露会加重气道炎性细胞浸润、细胞因子的释放及气道高反应性。临床研究[30]发现，烟曲霉菌等真菌致敏哮喘患者平均年龄低，重度哮喘比例高，且常存在对多种变应原敏感；这类哮喘患者住院时间、病程明显延长，有特有的临床表现，如憋喘较重、哮喘症状持续较久或病情反复、痰液黏稠呈拉丝状、口腔伴有黑褐色或白色苔膜等。烟曲霉菌致敏哮喘以及慢性烟曲霉菌暴露的哮喘与真菌感染直接相关，其对糖皮质激素的治疗效果欠佳，不仅需要做更多前瞻性临床试验明确抗真菌治疗疗效、安全性和对哮喘患者急性发作、恶化加重以及生活质量的有益影响，还需要进一步做更多基础实验探讨其发病机制，为其治疗提供新的方向。