原发性肝癌外周血免疫抑制细胞表达与中医辨证关系＊

张 巍，邵明亮，苗同国，吴宗耀，王 蕊

（1.石家庄市第五医院研究中心 石家庄 050000；2.河北中医学院 石家庄 050000）

原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）是一种多因素综合形成的恶性肿瘤之一，是世界范围内发病率第六位，死亡率第四位的肿瘤[1]。东亚地区病毒性肝炎（包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎），脂肪性肝病构成肝癌发病最重要的病原因素。慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染者经过长期抗病毒治疗仍然不能彻底清除病毒，乙肝病毒进一步整合到宿主基因，组形成共价闭合环状结构DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），导致HBV感染慢性化，将近35%-60%风险发为乙型肝炎病毒相关肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。免疫功能调节与HBV感染控制及疾病进展密切相关。免疫抑制细胞（MDSC）是一类的参与炎症、肿瘤过程的重要免疫细胞，能够强烈抑制细胞应答功能,近年来成为研究肿瘤免疫逃逸中的作用的热点[2]。

中医根据肝癌主要的症状、体征及临床发展过程，与“黄疸”、“胁痛”、“积聚”、“鼓胀”、“疫毒”、“郁证”、“肝瘟”、“血证”等病证的记载密切关联[3]。“湿、热、瘀、痰、毒、虚”构成本病的病因，个体表现各异，呈现一个动态变化的发展过程，诸多医家因此界定肝癌中医基本证候为血瘀、脾气虚、肝胆湿热、肝气郁结、肝阴虚、肾阴虚的六证。肝癌病机包括肝郁、气滞、脾虚、痰湿、血瘀、肾阴虚，随着病情的加重，证型有所不同。肝癌随着临床分期以及病情的加重，证型表现为为肝郁脾虚证-气滞血瘀证-湿瘀互结-肝肾阴虚证改变。我们长期临床观察发现原发性肝癌属本虚标实之证，以正虚为本，血瘀浊毒壅络为标。素体本虚，邪气则乘虚侵入而发病；病邪侵袭，又伤正气，互为因果。病程初期邪毒内蕴侵及肝胆，导致肝失调达、肝失疏泄，继则湿热气滞，湿、毒、痰、气相互壅结，湿阻痰盛，痰气郁滞，气血不通，而致虚实夹杂之证[5]。关注临床的肿瘤分期，肿瘤进展相关的免疫机制、免疫分子表达与中医辨证分型存在内在的联系，正是本课题的研究目的。旨在通过分析肝癌患者中医辨证分型是否与MDSC表达以及相关免疫细胞、因子水平有关，便于尽早预警肿瘤病情进展，提高患者生存率。

1 研究对象及方法

选取2011年5月至2015年1月于石家庄市第五医院接受治疗的HBV相关肝癌患者237例。其中男性151例，女性86例（性别比1.75∶1），年龄59.36±6.57岁（30-77岁）；按照BCLC分期A期98例，B期139例。所有病例均为初诊病例，未采用抗肿瘤治疗。

1.1 纳入标准

①诊断符合原发性肝癌诊疗规范（2011年版）[4]；②病例资料记录完整者；③患者可以持续随访者。

1.2 排除标准

①非原发性性肝癌的患者：如肉瘤、恶性淋巴瘤、转移性肝癌等；②脏器功能严重衰竭，顽固性大量腹水，明显的恶液质，意识障碍等已不再适合治疗的患者；③病例资料记录不完善者；④患者无法再次随访者。

1.3 主要试剂和仪器

人淋巴细胞分离液（Ficoll）购于天津灏洋生物制品科技有限公司；FBS购于美国Gibco公司，人单克隆荧光抗体CD33-PE-Cy5购于美国Biolegend公司，CDll b/Mac-1-PE-Cy7、HLA—DR-APC、CDl4-F1TC、CD3-FITC、CD4-PE-Cy5、CD8-PE-Cy7、同型对照抗体均购于美国BD公司；Centrifuge 5810R台式高速离心机，购于德国Eppendorf公司；BD FACS TM流式细胞仪购于美国BD公司。

1.4 外周血分离PBMC及抗体标记

术后6个月抽取患者外周静脉血10 mL血于EDTA抗凝管，2 h内18℃2000 r·min-1（离心半径9.5 cm）离心8 min。取血细胞加PBS稀释至18 mL，分两支管，每只管加4.5 mL Ficoll，将稀释的血细胞缓慢加到Ficol液面上方，18℃2000 r·min-1（离心半径9.5 cm）离心20 min。

吸取100 mL细胞悬液于流式管中，加入单克隆荧光抗CD33-PE-Cy5 5 μL、CD11b／Ma-1-PE-Cy7 5 μL、HLA-DR—APC 20 μL、CDl4一FITC 20 μL，同型对照管中加入同型对照抗体防止非特异性染色。轻弹流式管管底，混匀细胞与抗体，置于冰上避光温育30 min后，加PBS洗涤细胞2次，1500 r·min-1（离心半径9.5 cm）离心6 min。弃上清液，加300 μL PBS重悬细胞，再用流式细胞仪检测MDSC在单个核细胞中的表达频率。

1.5 HBV免疫学、肿瘤标志物检查

乙肝五项定量采用上海实业科华生物技术有限公司试剂盒常规酶联免疫方法检测。HBV-DNA检测采用罗氏公司荧光定量PCR法，检测灵敏度为＞500IU/L。AFP采用化学发光法检测，正常值＜10 mg·L-1。

1.6 Child-pugh评分

Child-pugh评分以ALB＞35 g·L-1（1分），Tbil＜34.2 μmol（1分），无腹水（1分），凝血时间延长1-3 s（1分），无肝性脑病（1分），总分＜6分为A级，7-9分为B级，＞10分为C级。

1.7 中医临床症状分型

肿瘤相关体格检查，如：是否伴肝区疼痛、消瘦乏力、伴发腹水、肝性脑病、黄疸等；中医分型标准参考卫生部年颁发的《中药新药临床研究指导原则（试行》标准[6]，脾虚证：神疲乏力，纳呆食少，腹胀，腹泻，舌淡，有齿痕，脉细弦。肝郁：情绪激动，脉弦，嗳气不爽，矢气较多；气滞证：右胁闷胀窜痛，胸闷，易怒，右胁助下痞块舌苔薄腻，脉弦。血瘀证：胁痛引背，纳差食少，便血，腹内包块，痛处不移，拒按，形体消瘦，舌质紫暗，脉沉细。阴虚证：腰膝酸软，五心烦热，排便困难，舌红少苔，脉细而数。

1.8 统计学方法

患者基线临床资料应用描述性分析，组间计数资料比较Fisher精确概率法，计量资料进行Shapiro-Wilk正态分布检验，用χ±s表示。非正态分布组间比较用秩和检验。采用SPSS17.0录入数据并进行统计学分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 患者的基线资料

对入组患者的情况统计资料（表1），男性患者（63.71%），年龄≥60岁（53.59%），具有肝癌家族史占（54.85%），Child-pugh B期占55.7%，肝硬化代偿期占（72.99%），未发生乙肝血清学转换占（77.63%），AFP ≥ 400 ng⋅mL-1占（56.55%）。

表1 237例原发性肝癌患者一般资料

表2 肝癌患者不同证型影响MDSC分析

表3 肝癌患者中医证型影响Th1/Th2分析

表4 肝癌患者IL-12/IL-4表达分析

2.2 肝癌患者不同证型影响MDSC分析

肝癌早期气滞血瘀证MDSC（24.21%）明显高于肝郁脾虚证（5.54%）差异具有显著性（Χ2=11.544，P＜0.05）（表2）。肝癌进展期湿瘀互结证MDSC（21.03%）表达高于肝肾阴虚证（5.10%）差异具有显著性（Χ2=8.223，P ＜ 0.005）

2.3 肝癌患者中医证型影响Th1/Th2分析

气滞血瘀证Th2表达高于肝郁脾虚组，组间比较具有显著性差异（t=10.341，P ＜ 0.05）（表3）。湿瘀互结证Th2表达高于肝肾阴虚组，组间比较具有显著性差异（t=16.307，P ＜ 0.01）。

2.4 肝癌患者中医证型影响IL-12/IL-4表达分析

气滞血瘀组IL-4（121.70±6.22）高于肝郁脾虚组（76.57±5.01）；组间比较具有显著性差异（t=21.414，P ＜ 0.05）（表4）。肝肾阴虚组IL-4（375.12± 5.31）高于湿瘀互结（115.46±4.15）组间比较具有显著性差异（t=12.455，P ＜0.05）。肝肾阴虚组IL-12（36.15±4.43）低于肝郁脾虚组（70.43±2.49），组间比较具有显著性差异（t=19.050，P＜0.05）。

3 讨论

《内经》云：“正气存内，邪不可干”，“邪之所凑，其气必虚”。《灵枢·百病始生》日：“虚邪之中人也……．留而不去，息而成积，或著孙络，或著输脉，或著于伏冲之脉，或著于膂筋，或著于胃肠之募原，上连于缓筋，邪气淫溢，不可胜论。”外邪之所以能侵入；而对人体而致瘤，关键还在于正虚，可见正气是维系人体正常生命活动、抗御外邪及防治疾病的基本物质。原发性肝癌发病机制极其复杂，病情发展与固有免疫和适应性免疫系统调节异常均有关[7]。本研究结果显示，肝癌患者气滞血瘀证MDSC（24.21%）明显高于肝郁脾虚（5.54%），肝癌进展期（＞5 cm）湿瘀互结MDSC（21.03%）表达高于肝肾阴虚（5.10%）。同类研究显示，肝癌患者进行短期随访观察后发现，外周血MDSC频率与患者病死率有关，可作为预测该类患者病死率潜在的指标。提示肝癌增殖过程中，突破细胞免疫防御同时[8]，“形诸于外”在中医体征上，发生辨证的改变，证实辨证分型更替具备免疫调节基础。

长期的慢性病毒性肝炎以及肝硬化病史致使肝癌患者肝脏内环境长期处于慢性炎症的状态，杀伤性T细胞被大量耗竭，肝脏处于免疫抑制状态。多种免疫细胞如T淋巴细胞、单核细胞、DC、Thl7细胞、Treg均被认为在HBV相关肝癌的发生、发展中起到了重要的作用[9]。原发性肝癌患者血清中展期肝癌组患者MDSC的比例明显高，Th1相关细胞因子IL-12、IL-2、IFN-γ的浓度明显升高，Th2相关细胞因子IL-4的水平显著升高。

MDSC分为两个亚型，即粒细胞样MDSC（G-MDSC）和单核细胞样MDSC（M-MDSC）。在早期肿瘤发生阶段，MDSC具有抗肿瘤免疫效果，进展期则转变为抗肿瘤免疫抑制，进而发挥负性作用[10]。多项研究证实，多个器官来源肿瘤细胞及骨髓来源细胞分泌的酶类通过MDSC有促进肿瘤的恶性化和侵袭（invasion）的作用[11]。一方面肿瘤细胞的生命活动受到周围“新生的”微环境中因子的调控，另一方面肿瘤细胞也通过自身的分泌活动影响周围的微环境。MDSC具有明显的免疫抑制功能，不仅能够抑制机体自身的抗肿瘤免疫，还可能削弱免疫治疗的效果。MDSC可能通过抑制抗肿瘤免疫反应促进了原发性肝癌的发生和进展。MDSC调节肿瘤免疫紊乱机制表现为：①MDSC通过募集前列腺素E、干细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子、IL-6等细胞因子诱导活化T淋巴细胞；②经过γ-干扰素、IL-4、IL-10、TGF等细胞因子激活后，通过分泌精氨酸酶1（Ar91）与一氧化氮合成酶，或诱导Treg的产生；③同时产生大量活性氧自由基和氧化亚硝酸盐，抑制T淋巴细胞功能，发挥间接免疫抑制作用。细胞因子的“级联激活”，造成全身炎症反应综合征（SIRS），患者机体存在类败血症样的免疫麻痹现象，导致细胞免疫抑制[12]。

本研究进一步分析，气滞血瘀证组Th2表达高于肝郁脾虚组，湿瘀互结Th2表达高于肝肾阴虚组。气滞血瘀组IL-4（121.70±6.22）高于肝郁脾虚组（76.57±5.01）肝肾阴虚证组IL-4（375.12±5.31）高于湿瘀互结组（115.46±4.15）组间比较具有显著性差异。相关研究证实代谢性肝病中气阴两虚证IL-4高于痰浊遏阻证，痰浊遏阻证Th1/Th2高于气阴两虚证组，细胞免疫通过多种免疫相关机制参与肝脏病理生理功能调节[13]。T细胞亚群是反映机体免疫功能的主要标志，肿瘤细胞可直接激活或诱导CD8+T细胞，使其含量上升抑制细胞免疫反应，进而导致CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均下降。当机体免疫功能降低，肿瘤细胞得以逃避免疫监视而呈进行性生长。

在肝细胞癌发生、发展过程中存在Th1/Th2比值下降Th2型细胞功能亢进而合成分泌大量的抑制性细胞因子，直接导致机体免疫功能下降，该比值及对应的指标在两组人群中的差别表明肝癌的发生与机体免疫功能有密切关系IL-4主要由Th2细胞分泌，随患者病情进展而逐渐升高，调控体液免疫反应，IL-4能增强肝癌细胞的免疫原性，更有效地激活特异性细胞毒T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，能上调肝癌细胞ICAM-1表达，下调肝癌细胞表面CIM4的表达，与细胞外基质中的透明质酸、胶原蛋白、纤黏蛋白、层黏蛋白等基质分子结合，参与细胞的迁移运动。与细胞骨架蛋白结合，启动肿瘤细胞浸润和转移，并抑制肝癌细胞对细胞外基质成分纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的亲和力[14]。

本研究揭示在气滞血瘀组中IL-4与痰湿、血瘀体征密切有关，推断在肿瘤局部具有微小栓塞形成保护肿瘤细胞免受免疫系统的攻击，提高肿瘤细胞在血管内皮上黏附的效率，促进肿瘤细胞成功外渗进入远端组织与组织内环境相互作用。多数研究认为原发性肝癌患者体内Th1/Th2细胞及相关细胞因子的失衡是肝癌发生发展的可能机制之一[15]。随着对细胞因子在原发性肝癌中作用机制的研究逐步深入，肿瘤炎性微环境中存在大量细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-17、IL-10和TGF-β等。它们不仅可以引起血管扩张，募集炎性细胞到肿瘤部位，放大炎症效应，还可促进肿瘤细胞生长，刺激血管、淋巴管生成以及促进肿瘤的浸润和转移示。

血清IL-2、IL-4浓度的动态变化可反映原发性肝癌的发生及发展过程，为原发性肝癌疗效及预后评估提供重要依据16。IL-12主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞产生，促使NK细胞活性增加，淋巴细胞数量的上升，与靶细胞的结合力增加，清除肝炎病毒，但同时也导致免疫损伤，影响趋化因子炎性局部浸润。IL-12增强免疫防御效应，相对正常健康者，慢性肝炎、肝肝硬化患者显著上升。癌症患者体内IL-12能够刺激NK细胞的增殖，在肿瘤免疫中起到重要作用。IL-12水平升高调节肝细胞癌患者Th1细胞功能降低和Th2细胞功能亢进现象，而这将导致患者机体免疫功能降低，并引起肿瘤细胞免疫逃逸。

中医肿瘤学临床实践是典型的实施个体化医疗的过程，体现在由复杂的外在局部的病变表现结合整体推断内在机制进行辨证论治，证候是辨证论治的核心，抓住证候才能推出治法，指导组方用药，实现肿瘤个体化治疗。但是中医辨证又是参杂医者一个的主观实践过程，在某种程度上会受到就诊当时人为因素的影响，中医证候确立客观化依据、量化指标仍缺乏。因此，对肝癌证候的生物学标志和分子免疫学甄别确定尤其重要。总结上述研究结果可以发现气滞血瘀证、肝肾阴虚证存在明显的细胞免疫功能抑制，通过MDSC调节IL-4表达，上调Th2细胞，参与肿瘤增殖，侵袭，转移过程。可以推断肝癌的体征变化导致了MDSC细胞免疫系统调节通过参与分子水平的变化，进一步观察免疫分子、细胞变化深入研究各个证型的演变机制，提高中 医辨证的精确性具有重要的临床价值。