开心散对多发梗死性痴呆大鼠学习记忆功能及ATP/AMP的影响＊

代 渊，申重阳，付 颖，文跃强，徐世军＊＊

（1.成都中医药大学养生与康复学院 成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所 成都 611137；3.成都中医药大学基础医学院 成都 611137；4.成都中医药大学药学院 成都 611137）

多发性脑梗是老年期痴呆的高危风险因素，多发梗死性痴呆（multi-infarction dementia，MID）是血管性痴呆的主要组成部分，分别占约占血管性痴呆（vascular dementia，VD）的39.4%和老年期痴呆8-12%[1,2]。脑能量不足或脑局部供能不足是导致学习记忆等认知功能低下的关键微环境改变。磷酸果糖激酶-1是糖酵解途径最重要的调节点，ATP/AMP能调节6-磷酸果糖激酶-1活性，当ATP浓度较高时，6-磷酸果糖激酶-1几乎无活性，糖酵解作用减弱；当AMP累积，ATP较少时，酶活性恢复，糖酵解作用加强。GABA是介导抑制性突触传导的递质，能提高葡萄糖代谢时葡萄糖磷酸脂酶活性，与脑能量代谢密切相关。iNOS是NOS活性氮自由基产生的催化酶，由巨噬细胞产生并能够生成高浓度的NO，高浓度的NO对脑组织产生毒性。源于《备急千金要方》的开心散是治疗“不忘”的经典方，在阿尔兹海默病方面研究报道较多，对血管性痴呆报道不多，仅有的两篇实验研究是永久性结扎双侧颈总动脉痴呆模型的报道[3-4]，对多发性梗死痴呆模型实验研究报道尚未见报道。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠，雄性，SPF级，70只，体质量（200± 20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物合格证编号：NO.51203500003215。

图1 KXS对模型大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数的影响（n=8）

1.2 药物及试剂

菖蒲、远志、人参、茯苓均购于成都中医药大学附属医院，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为符合药典标准，剂量比例根据《备急千金要方》开心散确定，药材5-6倍量的蒸馏水浸泡1 h后煎煮3次，每次煎煮1.5 h，合并煎液，过滤，80℃浓缩至浓度为0.6 g⋅mL-1，4℃保存待用。甲磺酸双氢麦角毒碱片（喜得镇），天津华津制药有限公司制造，批号：7C883T；苏木精，美国Thermo Fisher，批号：20170308；伊红，美国 Thermo Fisher，批号：20170308；ELISA试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，批号：Lot#R20180818；三磷酸腺苷二钠盐、二磷酸腺苷二钠盐、单磷酸腺苷二钠盐均购置于sigma公司。

1.3 仪器

Etho Vision Morris水迷宫分析系统（荷兰，Noldus）；OFT-100大小鼠开场活动实验系统（成都泰盟）；ODSHYPERSIL C18色谱柱（thermo）；1260高效液相色谱仪（Agilent）；Scentz DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机，KD-98-IIA恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；DM1000徕卡显微成像系统（德国，Leica）。

2 方法与结果

2.1 分组及给药

参考文献[5,6]造模，即通过颈外动脉向左侧颈总动脉“Y”分叉处缓脉注入0.4 mL含血栓的生理盐水混悬液（3.33 mg⋅mL-1），注射完后结扎颈外动脉近心端。假手术组注射等体积生理盐水。造模后连续3天给予0.2 mL的硫酸庆大霉素注射液防治感染。造模后2周，存活大鼠根据动物体重将造模大鼠随机分为模型组（Model）、喜得镇组（Hydergin，0.7 mg⋅kg-1）、开心散高剂量组（KXS H，2.12 g⋅kg-1）、开心散低剂量组（KXS L，1.06 g⋅kg-1），每组9只，除假手术组（Sham）和模型组（Model）每天一次给予等体积的蒸馏水外，其余各组灌胃给药相应药物，给药体积10 mL⋅kg-1，连续灌胃45天。

2.2 行为学评价

2.2.1 开心散对模型大鼠学习记忆功能的影响

参考文献[7]，采用Morris水迷宫进行测定，记录定向航行大鼠的逃避潜伏期和空间探索的穿越平台次数（图1）。

定位航行实验中，各组大鼠找到平台的潜伏期都在逐渐缩短，表明经训练学习后大鼠空间记忆力加强（图1）。与模型组比较,开心散低、高剂量组逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）。空间探索实验中，与模型组相比较，开心散低、高剂量组穿越平台次数显著增加（P＜0.01）。

2.2.2 开心散对模型大鼠运动行为的影响-开场实验

各组随机选取8只，将大鼠放入45 cm×45 cm×30 cm的敞箱，并将底部中心35 cm×35 cm区域划分为中心区域，由敞箱上方的摄像头监测小鼠在敞箱内自由活动3 min的活动轨迹，由软件记录与分析大鼠运动时间、静止时间、站立次数（图2）。

与模型组比较，开心散低剂量组、高剂量组站立次数均显著增多（P＜0.05），开心散低剂量组运动时间著增多（P＜0.05）、静止时间显著缩短（P＜0.05）（图2）。

2.3 开心散对模型大鼠海马病理形态学的影响

行为学实验完毕后，处死大鼠，随机取8只，冰浴取脑，分离脑组织。脑组织经4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，常规切片、制片和HE染色后进行染色,观察大鼠海马CA1区神经元形态变化。结果见图

模型组海马神经细胞数量明显减少，排列稀疏，可见明显的细胞固缩及空泡化；开心散给药组神经细胞数量减少，排列稀疏，细胞固缩及空泡化现象明显缓解（图2）。

图2 开心散对模型大鼠开场运动行为的影响（n=8）

图4 开心散对模型大鼠脑组织ATP/AMP和GABA及血清iNOS含量的影响

2.4 开心散多模型大鼠脑组织ATP/AMP、GABA和iNOS含量的影响

采用文献[8]方法，随机取5只，HPLC法测定新鲜脑组织ATP和AMP含量，计算ATP/AMP；随机取6只，采用ELISA试剂盒检测脑组织GABA和iNOS含量（图4）.

与模型组动物比较，开心散各剂量ATP/AMP显著升高（P＜0.05），GABA和iNOS含量显著降低（P＞0.05）（图4）。

3 讨论

我国脑梗死年均发病率约为216.6人/10万人，城市发病率更高。老年人群中无症状性多发性脑腔梗的检出率日益提高，多发性脑梗死在脑梗死中所占的比重居高不下，因脑梗造成脑组织累积性破坏形成的痴呆称为多发性梗死性痴呆（MID）。多发性腔隙性脑梗死患者多无明显神经系统定位症状和体征，但学习记忆等认知功能下降是有症状和无症状性多发性梗死性痴呆的共有表现。脑梗引起认知功能减退与脑梗塞发生的数量和部位密切相关，较为公认的是二者共同促进了认知缺损[9]。我们研究发现，多发性梗死痴呆大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数显著减少（P＜0.05）,开场实验的站立次数和运动时间显著减少（P＜0.05），静止时间显著增高（P＜0.05），海马CA1区椎体细胞数量明显减少，排列稀疏，可见细胞固缩及空泡化改变，表现出学习记忆障碍和运动行为学的异常及神经细胞损伤，与临床较为类似，经开心散干预后，学习记忆及运动行为明显改善，神经细胞损伤明显减轻，提示开心散可以改善多发性梗死所致的海马神经损伤并改善学习记忆等认知功能的改变。

多发性腔梗损伤首先涉及的是能量代谢障碍，而大脑能量代谢的水平可以通过脑组织中各种ATP酶的活性来反映。AMP是ATP脱去一个高能磷酸键的产物，ATP、AMP、ATP/AMP的变化与AMPK变化存在同步性，ATP/AMP降低可以激活AMPK[10]，AMPK为机体保持葡萄糖平衡所必需。激活的AMPK，一方面抑制消耗ATP的合成代谢途径，包括蛋白质、糖原合成、脂肪等物质的合成；另一方面刺激产生ATP的分解代谢途径，包括糖酵解、脂肪酸氧化、线粒体生物合成等，供应急所需，从而维持细胞内能量平衡[11]。由此可见ATP/AMP是反应细胞能量变化的一个关键指标，本研究发现，多发性梗死性痴呆模型大鼠脑组织ATP/AMP显著降低（P＜0.05），提示脑组织细胞功能不足，开心散干预后脑组织ATP/AMP显著增高（P＜0.05），说明开心散能够改善该模型脑组织的能量供应，进而维持脑细胞内的能量平衡。

GABA和iNOS既是脑缺血梗死的神经生化表征，也是导致脑能量障碍加重的重要因素。在脑缺血过程中，脑组织GABA含量呈现先增高后逐渐降低的动态变化。早期GABA急剧升高，通过突触抑制效应减少谷氨酸释放，降低兴奋性毒性而保护神经元，但随着病程的进展，脑缺血持续的病理损伤，GABA的合成会被关闭，继之GABA逐渐耗竭[12,13]。GABA含量的高低可通过葡萄糖磷酸脂酶活性影响脑能量水平。iNOS在缺血时表达并产生高浓度的NO，不仅可加速能量消耗，而且损伤DNA，导致神经细胞死亡[14]。临床研究发现，腔隙性脑梗患者血液呈高黏高凝状态，血管内皮存在微炎症[15]，致使脑组织到外周血葡萄糖摄取低下或不足。iNOS是炎症反应的标志，血清iNOS含量可以反应血管内皮微炎症水平。我们研究发现，多发性梗死性痴呆大鼠脑组织GABA和血清iNOS含量均显著增高（P＜0.05）,开心散可以抑制脑组织异常增高的GABA和血清iNOS含量（P＜0.05）