一种多拉菌素的制备方法

邓 意，李敬辉，杨通胜，倪立俊

（丽珠集团新北江制药股份有限公司 511500）

多拉菌素由阿维链霉菌的bkdFGH基因缺失突变株发酵过程中添加环己羧酸生物合成，为阿维菌素第三代衍生物，是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物，与阿维菌素相比，其在动物体内清除率较低、生物半衰期较长、生物利用率比较高，而且其注射剂的刺激性小，可进行肌肉注射，给药方便，持效期更长，一次给药就可以杀死动物体内的线虫和体外寄生虫，不需要重复给药，因此其在养猪业及宠物业上应用的比较广泛。

目前公开文献中多拉菌素发酵技术不仅存在发酵产量低的问题，而且大多都还处于实验室阶段，工业化进程缓慢，因此多拉菌素急需要一种适用于工业化大生产和发酵产量高的技术。

为了克服现有技术的缺陷，本研究提供了一种新的多拉菌素的制备方法。多拉菌素主要存在于发酵后的菌丝体中，是阿维链霉菌的次级代谢产物，因此影响其合成的因素很多，如碳源、氮源、温度等。另外，发酵产生多拉菌素的一个重要环节是加入前体物质环己羧酸或其盐，其补加量以及补加时间是工艺控制的重点。例如，环己羧酸或其盐添加量少，阿维链霉菌的代谢活动不会受到太大的影响，但是同时会因可转化为多拉菌素的前体少导致多拉菌素的发酵产量低；而添加过量的环己羧酸或其盐，会影响发酵培养基的物质平衡，过多的环己羧酸或其盐会抑制阿维链霉菌的代谢活动，也会导致多拉菌素发酵产量低。

从公开文献姜薇的硕士论文《多拉菌素的突变生物合成及发酵条件优化》、吴婕的硕士论文《多拉菌素产生菌的诱变育种及培养条件的优化》、 专利ZL201010568764.2、 专利ZL200710043687.7可以看到，现有技术的环己羧酸或其盐在发酵过程中只添加一次，添加的方式为配制发酵培养基时直接加入，在发酵后24h或者48h加入，各文献中添加量也可以相差十倍以上，并没有统一的添加标准。

在开发多拉菌素发酵工艺过程时，我们发现阿维链霉菌生长情况会随着发酵时间呈现一定的变化，定期的监测阿维链霉菌的生长情况，意外的发现，根据阿维链霉菌的生长情况，可以分2次加入环己羧酸或其盐以降低环己羧酸或其盐对菌种活力的影响；更进一步的，我们发现在发酵过程的前中期和后期，分2次加入环己羧酸或其盐，可以有效的增加前体物质环己羧酸或其盐的投料总量，同时尽可能降低前体物质环己羧酸或其盐对菌种的抑制作用，从而增加多拉菌素的发酵产量；发酵过程中2次添加环己羧酸的时间需要根据长期监测的阿维链霉菌生长情况确定，严格控制添加环己羧酸的时间可以有效的提高多拉菌素的发酵产量。

下面结合3个实验离子对本技术内容作进一步详述，材料配方及工艺参数的选择可因地制宜而对结果无实质性的影响。实验所用菌株：菌种Streptomyces avermiti1is XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。发酵培养基及配比：玉米淀粉80g/L，棉籽饼粉15g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，消泡剂1.6g/L，脱脂大豆粉15g/L，五水磷酸三镁2g/L，轻质碳酸钙7g/L，氯化钠1g/L，PH7.0。

实验1

1.1 配制 350L发酵培养基，121℃～123℃灭菌 20min。接种量 10%，接种后以罐温28.0℃±0.5℃、罐压 0.04MPa、流量 25m 3/hr、转速 80rpm 进行培养 228h。

1.2 补料策略 ：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40h加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵 180h加入，补加量为 0.6g/L。

1.3 发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5%～4.5%；最后放罐单位773mg/L。 环己甲酸盐为环己甲酸溶液中加入等物质的量NaOH，并配制成20%浓度的环己甲酸盐溶液。

实验2、实验3

2.1 培养条件与实验1相同，培养时间延长至312h。

2.2 发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5%～4.5%。

2.3 补料策略：实验1：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40h加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180h加入，补加量为0.6g/L。

2.4 实验2：补加一次前体环己甲酸盐，补加环己甲酸盐在发酵 40h加入，补加量为 1.6g/L。

2.5 实验3：补加一次前体环己甲酸盐，补加环己甲酸盐在发酵180h加入，补加量为 1.6g/L。

表1 前体环己羧酸添加次数筛选结果

所以，从表1的前体环己羧酸添加次数筛选结果可以得出，实验2和实验3的平均发酵单位均显著低于实验1的平均发酵单位，即说明补加两次前体环己羧酸更加符合菌株的生长情况。补加一次前体环己羧酸，不论是在发酵的前中期还是在发酵的后期，多拉菌素的发酵单位不如补加两次前体环己羧酸的发酵单位。