长链非编码RNA在子宫内膜异位症中的研究现状及前景

刘颂平 华克勤

1江苏大学附属第四医院妇科（江苏镇江212001）；2复旦大学附属妇产科医院妇科（上海200090）

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是妇产科的常见病和多发病之一，该病病理性质虽然是一种良性病变，但其生物学特性上却具有增生、浸润、远处转移、反复复发等一系列恶性行为，严重影响广大女性身心健康［1］。EMs具体发病机制迄今不明，存在多种学说。近年来，随着干细胞研究的飞速进展，EMs的干细胞发病学说日益受到重视［2］。长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）是一类转录产物长度超过200 nt但不能编码相关蛋白的RNA，在RNA水平上（表观遗传、转录以及转录后等）发挥基因表达调控作用［3］，是近年来的研究热点，其在干细胞及EMs基础研究领域已经得了一定进展，因此在EMs的干细胞发病学说方面具有广阔的研究前景。本文结合lncRNA在妇科恶性肿瘤及干细胞领域中的相关研究进展，将其在EMs中的研究现状及前景作一综述。

1 长链非编码RNA概述

在非编码RNAs超家族中，lncRNAs是比例最高的一类［4］，其缺乏开放阅读框，且序列具有保守性，最初被认为是基因转录的“暗物质”，不具有生物学功能。随着基因组高通量测序技术如深度测序和微阵列芯片等的不断发展，人们发现其具有非常重要的生物学功能。

lncRNA种类繁多，目前尚无十分有效的分类方法。根据lncRNA在基因组中与邻近蛋白质编码基因的位置关系，可分为反义lncRNA、基因内lncRNA、异质性lncRNA、基因间lncRNA和增强子式lncRNA。lncRNA主要存在于细胞核内，但在细胞质、细胞器内亦有一定分布，其具有较强的组织特异性，不仅不同组织间的表达量不同，甚至同一组织不同部位，不同发育阶段的表达都具有较大差异［5］。

目前，lncRNA的研究主要集中于lncRNA数据挖掘和功能验证两个方面，前者主要通过高通量测序技术的ln⁃cRNA⁃seq、lncRNA芯片检测技术、基于去除核糖体RNA（rRNA）的建库方法等，而lncRNA⁃seq主要包括lncRNA细胞水平验证与动物活体水平验证，其中在细胞水平上，常用的研究方法包括以下几种：（1）采用qRT⁃PCR定量检测lncRNA或对lncRNA⁃seq 测序数据进行验证［6］；（2）采取原位杂交技术、FISH技术对lncRNA进行定位分析［7］；（3）通过构建lncRNA载体，对lncRNA进行获得性或功能缺失方面的研究，或者利用反义寡核苷酸链（ASO）、siRNA等抑制细胞内目标lncRNA 的表达［8］；（4）通过RNA pull down、RNA⁃IP、CHIRP⁃seq等方法来确定能与目标lncRNA相互作用的蛋白质、RNA 和 DNA［9⁃10］。

lncRNA的功能复杂，目前研究最多的是其作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）发挥生物学调控作用这一方面。早在2011年就有学者提出了“ceRNA假说”［6］，认为细胞内存在ceRNA，这些ceRNA分子（mRNA，lncRNA、假基因等）能够通过miRNA应答元件竞争结合相同的miRNA以调节彼此表达水平。lncRNA作为一类重要的ceRNA，其通常通过与miRNA互补配对形成复合体，从而导致细胞内参与下游基因调控的miRNA的数量降低。例如，在心肌梗死和细胞自噬的发生发展过程中，lncRNA⁃APF通过与miR⁃188⁃3p结合，导致了下游靶标ATG7的表达量出现下降［7］。lncRNA的其他功能还包括：调节组蛋白修饰与染色质重塑、转录调节其他基因的表达、影响其他RNA生成、作为小RNA分子的前体等，其通过各种途径在生物学调控过程中发挥重要作用。

2 长链非编码RNA与妇科恶性肿瘤

研究显示，lncRNA通过参与肿瘤细胞凋亡调控、肿瘤浸润与转移过程，以及通过表观遗传调控的方式影响肿瘤细胞的生长等在恶性肿瘤的发生和进展中发挥重要作用［8］。

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤，通过非编码RNA组科学数据库（NONCODE）筛选与宫颈组织相关的lncRNA，结果显示与宫颈癌发病有关的lncRNA主要包 括 H19、HOTAIR、ANRIL、SRA、MALAT1、BCYRNl与UCA1。H19长度约2.3 kb，位于小鼠7号染色体末端和人类同源区域染色体的11p15.5区，可作为致癌或抑癌基因在肿瘤的发生、发展及预后方面发挥作用。研究显示［9］，H19在宫颈癌细胞系中高表达，过表达和敲减实验证实H19促进细胞增殖和肿瘤细胞克隆形成，但是并不影响细胞凋亡和迁移。有学者对TCGA数据库和12个独立研究结果进行多元回归分析显示［10］，H19高表达是宫颈癌独立的不良预后因素。HOTAIR在宫颈癌组织表达上调，而miR⁃17⁃5p表达下调，两者呈负相关，敲除HOTAIR抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，荧光素酶报告基因显示miR⁃17⁃5p直接与HOTAIR的3′⁃UTR结合，miR⁃17⁃5p 敲除可以使沉默HOTAIR后导致的肿瘤细胞抑制得以恢复，因此可以认为HOTAIR作为miR⁃17⁃5p的分子海绵发挥促进肿瘤生长的作用［11］。此外，文献显示，lncRNA ANRIL可以通过PI3K/Akt途径促进宫颈癌肿瘤细胞生成，其高表达提示预后不良［12］，MALAT1的表达与宫颈上皮组织HPV感染呈正相关，其通过诱导上皮细胞间质转化（epithelial⁃tomesen⁃chymal Transition，EMT）促进宫颈癌的侵袭和转移，可以作为宫颈癌预防和治疗的靶点［13］。

子宫内膜癌是发达国家最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，在美国每年约有39 080例新发病例，7 400例死亡病例。XU等［14］通过GO分类法和KEGG数据库发现子宫内膜癌与正常子宫内膜间存在172个差异lncRNAs，但其具体与子宫内膜癌发病之间关系的研究相对较少。研究显示［15］，H19通过抑制 let⁃7，一种转录后抑制致癌基因的肿瘤抑制因子，促进子宫内膜癌肿瘤细胞的迁徙和侵袭，二甲双胍可以通过DNA甲基化下调H19抑制肿瘤细胞生长，这一途径有望成为子宫内膜癌新的治疗靶点。另一研究显示［16］，H19在子宫内膜癌组织的表达明显高于癌旁组织，敲除H19显著抑制内膜癌HEC⁃1⁃B细胞系的迁徙和侵袭能力，H19表达下调能够使Snail水平下降，E⁃cadherin水平升高，从而使EMT得以部分恢复，因此认为H19可以通过调节EMT过程促进子宫内膜癌的发展。WANG等［17］发现，lncRNA BANCR在子宫内膜癌中表达增加，且与患者FIGO分期、病理类型、有无肌层浸润、淋巴转移有关，体外实验中，敲除BANCR后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制，MMP2和MMP1表达减少，ERK/MAPK信号通路受到抑制，认为BANCR通过调节MMP2/MMP1表达，激活ERK/MAPK信号通路促进内膜癌的发生发展，有望成为其预后指标和治疗靶点。另有学者发现［18］，GAS5在子宫内膜癌中具有肿瘤抑制作用，其能够通过提高抑癌基因PTEN的表达促进肿瘤细胞凋亡，从而在子宫内膜癌的发病中的发挥重要的调节作用。

卵巢癌缺乏有效的早期筛查手段，诊断时大部分患者已达晚期，5年生存率不超过45%［19］，居妇科恶性肿瘤病死率首位。近年来研究显示［20］，lncRNA在卵巢癌不同发展阶段显示出不同生物学功能，其表达水平与早期诊断、预后及对化疗的敏感性有关。微阵列分析显示［21］，卵巢癌组织与正常卵巢组织间差异表达的lncRNA上调者672个，下调者549个。WU等［22］研究发现，lncRNA ABHD11⁃AS1在卵巢癌中表达升高，与肿瘤分期及分化程度有关，其通过直接与RhoC结合，使其下游分子P70s6k、MMP2和BCL⁃xL的表达增加，促进卵巢癌A2780及OVCAR3细胞系的增殖、侵袭和迁移，在裸鼠动物体内实验中亦显示出类似的影响。JIN等［23］研究发现，MALAT1在卵巢癌组织及细胞系中均表达上调，与患者5年生存率呈负相关，其通过PI3K/AKT信号通路促进EMT参与卵巢癌的发生发展。化疗耐药是影响卵巢癌预后的重要因素，部分lncRNA与化疗药物的耐药密切相关。研究显示［24］，HOTAIR通过wnt/β⁃catenin信号通路促进卵巢癌细胞增殖，即细胞周期进展，敲除后细胞增殖受到抑制，细胞停留于G1期，原代细胞培养发现HOTAIR的表达增加与卵巢癌化疗耐药有关，体外及体内实验均显示，HOTAIR通过wnt/β⁃catenin信号通路促进卵巢癌细胞对顺铂耐药，该过程在使用wnt/β⁃catenin抑制剂后得以逆转，因此认为HOTAIR可以作为卵巢癌潜在的治疗靶点。

3 长链非编码RNA与子宫内膜异位症

3.1 lncRNA在子宫内膜异位症发病机制中的研究进展EMs迄今为止病因不明，存在多种学说，但均不能充分阐述其具体发病机制。近年来，随着测序技术的不断进步，越来越多的lncRNA被发现，其功能相继得到验证，在EMs的基础研究中亦取得了重要进展，为探讨EMs的发病机制提供了新的思路。2014年有研究者报道［25］，EMs异位内膜较在位内膜存在948个差异lncRNA及4 088个差异mRNA，其中差异lncRNAs主要通过蛋白编码基因的顺式和（或）反式调节参与EMs的生物学行为。2015年另一研究显示［26］，取EMs患者在位内膜与正常子宫内膜（均为晚分泌期）进行微阵列分析，发现两者间存在1 277个差异lncRNAs（488上调，789个下调），功能分析提示与细胞周期及免疫调节有关，进一步采用qRT⁃PCR进行部分验证，证实CDK6和AC002454.1与EMs发病有关。

文献报道［27⁃29］，lncRNA中的单核苷酸多态性与EMs的易感性密切相关，在EMs的发生发展中发挥作用，相关结果在不同地域人群中亦得到验证。EMs与lncRNA之间关系的研究目前主要集中于几个常见的lncRNA，如ANRIL、H19等。研究显示［30］，ANRIL由染色体9p21区编码，该区域与多种疾病发生有关，已经证实ANRIL与心血管疾病、糖尿病、几种常见的恶性肿瘤及EMs发病有关，其通过调节邻近的肿瘤抑制基因CDKN2A/B进而调节细胞的增殖和凋亡参与疾病的发生发展。ANRIL又名CDKN2B⁃AS1，LEE等［31］通过比较673例EMs患者及500例对照组发现，CDKN2B⁃AS基因中Rs10965235及WNT4基因附近的rs16826658的单核苷酸多态性在韩国人群中与EMs的发病有关。而有关ANRIL在EMs中的具体作用机制，NAKA⁃OKA等［32］认为其主要通过等位基因失衡等一系列因素结合的染色质相互作用介导的基因表达的转录调控来实现的。有关H19与EMs的关系，研究显示［33］，H19在EMs患者在位内膜中的表达明显降低，而let⁃7水平升高，进而抑制Igf1r转录后水平的表达，可以导致子宫内膜间质细胞增殖能力下降，研究者推测H19/Let⁃7/IGF1R调节通路可能损伤EMs患者妊娠内膜的准备和容受性，在此基础上首次报道了基于lncRNA的EMs不孕机制，为探索新的治疗方法提供了理论基础。此外，最新研究证实［34］，通过采用含有lncRNA LINC00261的质粒转染EMs细胞系 CRL⁃7566，可以诱导细胞凋亡，从而导致细胞增殖受到抑制，细胞迁徙能力亦出现减退。

EMs是一种雌激素依赖性疾病［35］。LIN等［36］发现，雌激素与其核受体ER⁃α、ER⁃β在EMs中具有重要功能，类固醇受体RNA激动子1（SRA1）产生SRA LncRNA和SRA蛋白质（SRAP），其可以在雌激素依赖性疾病中通过选择性剪切事件在RNA和蛋白水平调节ER表达，SRA lncRNA和 ER⁃α在EMs中低表达，而SRAP和ER⁃β呈高表达，SRA1小干扰RNA治疗能够明显增加异位内膜间质细胞ER⁃α的表达，却降低ER⁃β的表达，同时使细胞增殖减少及凋亡增加，提示在EMs中通过SRA调节ER可能在异位内膜间质细胞的生长中发挥重要作用。同时，有学者［37］采用免疫组化法检测了组织中SRAP和ER⁃β的表达，发现在从EMs到不典型EMs、EMs恶变透明细胞癌组织中，SRAP的表达逐渐升高，而ER⁃β的表达逐渐降低，两者呈负相关，认为SRA与EMs的恶变有关。

3.2 lncRNA在子宫内膜异位症干细胞发病学说中的研究前景 我们知道，人体组织细胞均由干细胞分化而来，因此可以认为子宫内膜细胞以及EMs病灶细胞自然也是由相应的干细胞分化而来。21世纪初就有学者提出了EMs干细胞发病学说的设想，随着研究的不断深入，EMs的干细胞起源学说日益受到认可。干细胞因子是一种多功能细胞因子，能够刺激多种组织细胞的生长发育和增殖，而EMs患者腹腔液中的干细胞因子水平较正常妇女明显升高；同时，单克隆性是干细胞的重要特征之一，而EMs虽为多中心起源，但其每一局部病灶细胞却呈现明显的单克隆性，以上现象均支持EMs病灶可能来源于干细胞。由此有学者提出，EMs患者病灶中存在具有干细胞特性或可塑性的未分化的或者未完全分化的细胞，这些不同分化程度的细胞对EMs的发生和发展发挥了重要作用。

子宫内膜是一种周期性更新的组织，具有高度增殖活性。早在1978年，PRIANISHNIKOV已经推测可能存在子宫内膜干细胞。2004年有学者通过克隆形成能力的鉴定于子宫内膜上皮和基质细胞中证实了子宫内膜干细胞的存在，并于2006年进一步采用标记剩余技术（label Retaining cells，LRC）使内膜干细胞得到成功分离和鉴定。TAYLOR等则首次报道子宫外的干细胞亦同样能够分化生成子宫内膜组织，其检测了骨髓移植后女性患者的子宫内膜，结果发现存在来源于骨髓内膜细胞，认为骨髓间充质干细胞能够分化形成内膜组织，在此基础上提出干细胞的异位分化同样可以导致EMs，成为EMs干细胞病因学的重要内容。总的来说，目前EMs干细胞发病机制的研究有许多未知的、值得探讨的问题仍在研究当中，尤其lncRNA在EMs干细胞发病机制的研究尚处于起步阶段，具有广阔的研究前景。

迄今为止，研究者已经通过各种方法从EMs中分离出间充质干细胞并认为其参与该病发生发展中的重要环节，有望成为新的治疗靶点，但其具体机制及途径不明［38⁃39］。目前有关lncRNA在EMs间充质干细胞中的研究较为少见，但已有较多文献证实lncRNA通过各种途径影响间充质干细胞的分化过程及参与细胞干性的保持。ZHANG等发现［40］，lncRNA DANCR对于滑膜起源的间充质干细胞（synovium⁃derived mesenchymal stem cells，SMSC）的成软骨功能十分重要，其具体机制为DANCR的过度表达使miR⁃1305下调，而后者通过改变TGF⁃β信号通路成员Smad4影响细胞增殖和SMSC细胞的成软骨功能。同样，lncRNA在间充质干细胞的成骨分化中同样发挥重要作用。LIAO等发现［41］，lncRNA H19在成骨因子BMP9诱导间充质干细胞分化早期明显上调其水平，随后迅速下降并逐渐恢复基础水平，这一过程与BMP9诱导的成骨细胞标记物的表达有关，有趣的是，不论体外或体内实验中，H19在间充质干细胞表达或沉默均明显损伤BMP9诱导的成骨分化过程，且能够被Notch信号通路的激活所解救，表现为与这一信号通路中配体或受体相结合的一组miRNA表达的增加，因此认为lncRNA H19作为成骨因子BMP9的重要调节子，可以通过调节Notch信号通路靶向结合的miRNAs实现其对间充质干细胞成骨分化的调节功能，其异常表达可能损伤正常成骨过程，导致骨肿瘤的发生。此外，体外实验证实［42］，lncRNA⁃Bvht可以通过升高心肌特异性转录因子及EMT相关基因的表达促进间充质干细胞向心肌细胞的分化，而lncRNA ⁃MEG3通过调节miR⁃140⁃5p参与人脂肪源性间充质干细胞向成脂和成骨分化过程的平衡［43］。鉴于lncRNA在其他组织间充质干细胞方面的研究成果，进一步探索其在EMs间充质干细胞干性维持、多能分化等方面的具体作用机制及途径，将在一定程度上促进EMs干细胞发病学说的发展。

总的来说，lncRNA可以通过不同的调控机制参与EMs的发生、发展，可能成为诊断和评价预后的一个有效生物学标志物及基因治疗的新靶点。然而，目前有关lncRNA与EMs的研究目前并不多见，尚不深入，尤其有关lncRNA在EMs干细胞发病机制中的研究尚处于起步阶段，期待未来科学工作者可以在此领域进行更多更深的探讨，必将为EMs的诊治提供新的思路。