三味龙胆花片对过敏性哮喘小鼠模型的平喘作用研究

赵学勇，高玥 ，李彦桥，方洋，苏思雨，张静波，古锐

过敏性哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，因暴露于过敏原导致间歇性气喘，气道高反应性，喘息和咳嗽[1]。过敏性哮喘发病率高，在全世界范围内，超过3亿人受到这种疾病的影响，过敏性哮喘已经成为工业化国家和发展中国家公共卫生服务日益增加的负担。

对于过敏性哮喘的治疗，西药应用的较多，但存在药物不良反应的难题。中药具有多成分、多靶点的特点，在治疗过敏性哮喘方面可发挥其作用。三味龙胆花片为一种上市的藏成药，组方为白花龙胆、甘草、蜂蜜干膏。具有清热，润肺的功效，用于治疗肺热气喘和咽喉炎。本研究拟通过观察小鼠的引喘潜伏期、ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-4、IFN-γ水平以及肺组织病理，以此来评价三味龙胆花片对于过敏性哮喘的治疗效果,为其临床疗效提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

6周龄雌性BALB/c小鼠，SPF级，由成都达硕实验动物公司提供，批号：SCXK（川）2015-030。

1.2 实验药品及制备

三味龙胆花片由宇妥藏药股份有限公司提供，批准文号：国药准字Z20100069，批号：171002。三味龙胆花片高、中、低剂量组的给药剂量分别为3.43 g﹒kg-1、1.71 g﹒kg-1、0.86 g﹒kg-1，即成人每日剂量的20倍、10倍、5倍。醋酸地塞米松片由国药集团容生制药有限公司提供，批号：161016。醋酸地塞米松的给药剂量为0.05 g﹒kg-1。

1.3 实验仪器

超纯水器，四川优普超纯科技有限公司，型号：ULUP-I；离心机，美国BECKMAN COULTER公司，型号：Allegra X-30R Centrifuge；高级多功能酶标仪，美国Thermo公司，型号：Varioska；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机，常州市中威电子仪器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋机，常州郊区中威电子仪器厂；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪，常州市中威电子仪器有限公司；980型超声雾化器，上海天缘医用生物有限公司。

1.4 实验试剂

卵清蛋白，美国SIGMA公司，批号：SLBQ9036V；氢氧化铝凝胶佐剂，美国Thermo公司，批号：SL255649；小鼠白细胞介素4（IL-4）高敏试剂盒，联科生物MULTI SCIENCES公司，批号：204H80442；小鼠γ干扰素（IFN-γ）试剂盒，联科生物MULTI SCIENCES公司，批号：228080442；羧甲基纤维素钠，成都市科龙化工试剂厂，批号：20130530；水合氯醛，成都市科龙化工试剂厂，批号：20111123；生理盐水，四川科伦药业股份有限公司，批号：L217071712；磷酸盐缓冲盐溶液，biosharp公司，批号：163061。

2 方法

2.1 动物分组及给药

6周龄雌性BALB/c小鼠60只，按照体重随机分为空白对照组，模型组，三味龙胆花片高、中、低剂量组，地塞米松组。于激发前1h给药，各组灌胃给药 7 d，每日 1 次，期间自由饮食。

2.2 建立模型

参照前人方法[2～6]复制过敏性哮喘小鼠模型。2.2.1 致敏液和引喘液的制备卵清蛋白致敏液： 精密称取卵清蛋白（OVA）0.025 g置于250 mL的容量瓶中用生理盐水定容至刻度线。取10 mL卵清蛋白生理盐水溶液于小烧杯中，并将5.6 mL的氢氧化铝凝胶佐剂缓慢加入卵清蛋白生理盐水溶液中进行乳化，用于致敏，现配现用。

引喘液：用生理盐水配制浓度1.5% 的卵清蛋白引喘液（即将1.5 g的卵清蛋白溶于100 mL的生理盐水中），用于引喘，现配现用。

2.2.2 致敏于第1、8、15天分给模型组、地塞米松组、三味龙胆花片高、中、低剂量组每只小鼠腹腔注射0.16 mL致敏液以致敏，空白对照组用等量的氢氧化铝凝胶佐剂生理盐水代替。

2.2.3 激发 从第19天开始，将模型组、地塞米松组、三味龙胆花片高、中、低剂量组小鼠分別置于密闭容器内，给予1.5% OVA引喘液超声雾化吸入以激发。空白对照组以生理盐水进行雾化。每日1次，每次15 min，连续7 d。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 小鼠状态观察 观察小鼠的精神、呼吸状况，饮食、搔鼻抓面情况、体重变化等。

2.3.2 小鼠引喘潜伏期的观察与测定实验第19、21、25天分别于雾化激发时，观察记录每只小鼠引喘潜伏期（即从喷入1.5%卵清蛋白液开始至小鼠出现呼吸急促、腹肌收缩凹陷的时间），观察记录15分钟,以“秒”为计算单位，共记录3次，将3次结果的平均值作为最终结果，若潜伏期超过15min，则引喘潜伏期以900秒计。

2.3.3 ELISA法检测BALF中IL-4、IFN-γ末次激发后3 h，腹腔注射10%水合氯醛25 mL﹒kg-1使小鼠麻醉致死，颈部正中切开，暴露气管和胸腔，结扎右肺。将静脉留置套管针插入气管，拔出针管并结扎气管，连接注射器，经注射器依次注入0.4 mL、0.3 mL、0.3 mL磷酸盐缓冲盐溶液，每次注入反复抽吸3次，回收支气管肺泡灌洗液至离心管内，经1500 rpm、4℃离10 min，分离上清液，用于ELISA检测。BALF上清液按 ELISA 试剂盒说明书操作，在450 nm和570 nm处测吸光度值，通过绘制标准曲线求出标本中IL-4及IFN-γ的实际浓度。

2.3.4 肺组织病理取右侧肺组织置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h，经石蜡包埋、组织切片，常规脱蜡脱水，苏木素-伊红（HE）染色后在光镜下观察各组小鼠肺组织的病理变化。

2.4 统计学方法

采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计处理。数据资料以均数±标准差（x±S）表示，符合正态分布采用单因素方差分析，组间比较采用 LSD 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般状态

模型组小鼠经抗原刺激后，出现烦躁不安，精神较差，呼吸急促，腹肌凹陷，搔鼻抓面频繁，饮食和饮水量减少，体重减轻明显；空白对照组小鼠呼吸均匀平稳，无搔鼻抓面，饮食正常，体重增加；三味龙胆花片各组和地塞米松组出现呼吸急促、搔鼻抓面，但频率和程度均较轻，体重轻微下降。

3.2 小鼠引喘潜伏期

与空白对照组相比，模型组小鼠引喘潜伏期明显缩短，有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，三味龙胆花片高、中、低剂量组与地塞米松组引喘潜伏期明显延长（P＜0.01），实验结果如表1所示。

表1 各组小鼠引喘潜伏期比较（±s，n=10）

表1 各组小鼠引喘潜伏期比较（±s，n=10）

注：与模型组比较，**P＜0.01

组别 给药剂量（g﹒kg-1） 引喘潜伏期（s）空白对照组 - 900.00±0.00**模型组 - 202.17±13.74地塞米松组 0.05 408.30±14.66**三味龙胆花片低剂量组 0.86 320.30±28.09**三味龙胆花片中剂量组 1.71 395.73±22.06**三味龙胆花片高剂量组 3.43 406.81±52.25**

3.3 BALF中IL-4、IFN-γ的表达情况

与空白对照组相比，模型组IL-4水平明显升高，且具有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比，三味龙胆花片低剂量组和中剂量组IL-4水平降低（P＜0.05）；地塞米松组和三味龙胆花片高剂量组IL-4水平明显降低（P＜0.01）。

与空白对照组相比，模型组IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值降低，具有极显著性差异（P＜0.01）。与模型组相比，地塞米松组和三味龙胆花片各剂量组IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值升高，均具有显著性差异（P＜0.05），具体实验结果如表2所示。

表2 各组小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表达情况（±s，n=10）

表2 各组小鼠BALF中 IL-4、IFN-γ的表达情况（±s，n=10）

注：与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

组别 给药剂量（g﹒kg-1）IL-4（pg﹒mL-1）IFN-γ（pg﹒mL-1） IFN-γ/IL-4空白对照组 - 17.56±5.30**496.64±24.54**30.72+8.77**模型组 - 44.76±12.92 304.48±49.85 7.63+3.30地塞米松组 0.05 28.25±8.00** 367.64±41.29* 13.71+3.05**三味龙胆花片低剂量组 0.86 33.68±8.90* 341.20±16.02* 10.70+2.20*三味龙胆花片中剂量组 1.71 32.61±4.73* 347.83±40.00* 10.77+1.22*三味龙胆花片高剂量组 3.43 30.52±4.44** 354.61±45.31* 11.89+2.28**

3.4 肺组织病理学改变

3.4.1肉眼观察 空白对照组肺组织为淡粉红色，表面湿润有光泽，质地柔软。模型组肺组织颜色暗红，明显充血肿大，可见瘀斑淤点。各给药组肺组织出现片状红色，轻度肿大。

3.4.2镜下观察 空白对照组肺脏各级支气管和肺泡结构正常，支气管纤毛上皮排列整齐；模型组支气管上皮细胞增生，支气管管腔内可见较多的粘液分泌物，血管上皮细胞变性、脱落，肺间质水肿，伴有炎性细胞浸润，局部炎细胞聚集形成不规则炎性灶，细胞成分增多；地塞米松组和三味龙胆花片各剂量组支气管管腔内见少量炎性渗出物，支气管上皮细胞增生，肺间质水肿，伴有少量淋巴细胞浸润、炎细胞聚集。其中地塞米松组和高剂量组治疗效果相对较好。

图 1 各组小鼠肺组织病理图片（HE染色 400×）

4 讨论

三味龙胆花片为一种上市的藏成药，组方为白花龙胆、甘草、蜂蜜干膏。具有清热，润肺的功效，用于治疗肺热气喘和咽喉炎。方中白花龙胆为君药，来源于大花龙胆Gentiana szechenyii Kanitz、岷县龙胆G. purdomii Marq.、高山龙胆G. algida Pall.的花或花枝，藏名为榜间嘎保[7]。《图鉴》记载：白花龙胆生长在草山坡。叶小，花繁盛。味苦，功效治热性时疫。《铁螯》中记载：“白花龙胆性凉、味涩，治一切热病，解毒，利喉。”

引喘潜伏期能够评价小鼠暴露于激发环境中的症状表现。本研究观察记录各组小鼠的引喘潜伏期，与模型组相比，三味龙胆花片给药各组均能显著延长小鼠的引喘潜伏期。

有研究认为，哮喘和炎症与IL-4的产生增加和IFN-γ的产生减少有关[8]。过敏性哮喘为Ⅰ型过敏反应。Ⅰ型过敏是由过敏原的特征性免疫反应引起的，主要由Th2细胞介导。IFN-γ主要由Th1分泌，而Th2细胞可分泌IL-4。Th2细胞合成高水平的IL-4，导致过敏原特异性免疫球蛋白（Ig）E的产生和肥大细胞释放介质。Th1细胞通过分泌IFN-γ来抑制Th2免疫应答。Th1与Th2细胞相互抑制，平衡消长，维持着动态平衡状态。Th1细胞功能下降，一方面会诱发IFN-γ合成的不足，降低其抑制B细胞的活化和特异性IgE分泌的作用；另一方面将直接导致其抑制Th2细胞发育的功能减弱，诱发Th2细胞功能异常增高，导致IL-4、IL-5大量分泌，促进EOS的分化和激活[9]。因此，估计Th1 / Th2细胞因子平衡关系是评估哮喘的重要工具。本研究通过考察支气管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平，以及计算IFN-γ/ IL-4比值，考察三味龙胆花片对于过敏性哮喘的治疗作用。ELISA结果显示模型组小鼠 IL-4水平升高，IFN-γ水平降低；三味龙胆花片各组均能不同程度地降低IL-4水平，同时升高IFN-γ水平，提示三味龙胆花片对过敏性哮喘的治疗作用。

综上所述，三味龙胆花片可改善小鼠雾化激发表现、延长小鼠引喘潜伏期、降低支气管肺泡灌洗液中IL-4水平、升高IFN-γ水平、改善肺组织病理形态，提示三味龙胆花片对过敏性哮喘有一定的治疗作用，为其临床疗效提供了实验依据。