组织工程骨激活低氧诱导因子HIF-1α促进骨修复

邓正炜，张亚东，赵世昌

(1.上海中医药大学，上海 200120；2.上海健康医学院附属第六人民医院南院骨科，上海 201400；3.上海市第六人民医院骨创伤外科，上海 200030)

低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是组织细胞在低氧状态下激活相应基因转录的核心调节因子之一，在骨发育和代谢过程中起到十分关键的作用。现将激活HIF1-α信号通路的方法、作用机制和潜在应用价值加以综述。

1 低氧诱导因子-1α与骨代谢

组织细胞缺血、缺氧状态下表达的HIF-1α是诱导低氧基因和维持细胞内氧环境稳定的核心转录因子，参与调控血管生成、炎性细胞及干细胞归巢、细胞分化、糖代谢等众多生理病理反应[1]。机体内多数组织器官在生理条件下都维持20%左右的氧分压，而骨骼及骨髓腔处的低氧状态的氧分压只有1%～7%，因此骨骼内的多种细胞在生理状态下都表达为HIF-1α[2]。HIF-1α通过调控下游的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、促血管新生蛋白因子-2(angiopoietin-2)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)等一系列靶标因子从而实现对血管形成过程进行调控。在正常氧分压的情况下，HIF-1α被低氧诱导因子脯氨酰羟化酶(hypoxia inducible factor proline hydroxylase，HIF-PH)羟基化，从而使其泛素化并降解，在缺氧情况下，HIF-PH被抑制使得HIF-1α在细胞内积累进而调节细胞的生命活动。常规HIF-PH抑制剂可以抑制HIF-PH活性进而激活HIF-1α促进细胞的募集、分化和血管形成[3]。

首先，HIF-1α高表达可以提供良好的血供和充分的氧气，促进VEGF的表达从而促进血管的生长，也有利于促进骨生长的部分细胞增殖和生长因子的分泌。HIF-1α对血管诱导作用和对干细胞归巢引导作用具有强控制力，可以从根本上改善骨折周围软组织的生长条件。HIF-1α在低氧信号中是一个关键的转录因子，能够增加和调节氧含量和营养代谢从而维持能量和氧化还原平衡[4]。同时，激活HIF-1α促进骨代谢的临床和动物模型中，组织工程骨(tissue engineering bone，TEB)因其特性突出、可修饰性强等特点而广泛被研究应用[5]。目前，常见的激活HIF-1α通路的方法包括：HIF-PH抑制剂植入、基因干预、材料功能性(孔径大小、表面修饰、组织相容性、生物降解性[6]、力学强度等)改造、3D打印技术和中医药干预等。

2 激活HIF-1α通路促进骨修复在骨组织工程中的应用

激活HIF-1α通路可以促进骨代谢及骨修复。激活HIF-1α最常见的方法为使用HIF-PH抑制剂，它们包括CoCl2、去铁胺(deferoxamine，DFO)[7]、二甲基乙二酰氨基乙酸(dimethyloxallyl glycine，DMOG)、含羞草素(L-mimosine，L-mim)[8]等。目前研究显示，铜离子植入、基因的敲低或过表达、组织工程骨的加工和药物添加等方式均可一定程度上提高HIF-1α表达。激活HIF-1α的方法包括以下几类。

2.1 HIF-PH抑制剂

2.1.1 钴离子(Co2+) 介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)添加钴离子(Co2+)可以激发支架对低氧做出反应。Quinlan等[9]将MBG分别与钴(Co2+)一起并入玻璃网络中制备了复合型Co2+/MBG/胶原蛋白-粘多糖支架，能显著增强VEGF的生成和表达进而促进血管形成。Wu等[10]研究发现Co-MBG复合生物支架显著提高了VEGF蛋白的分泌，提高了HIF-1α、骨相关基因在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)中的表达，促进了BMSCs的附着和增殖。同时Co2+肌肉注射也可以激活生命体对低氧做出反应[11]。Huang等[12]用CoCl2/生理盐水腹膜全身给药处理胫骨骨折的大鼠，发现CoCl2显著促进骨折愈合、提高机械强度并增强骨折活体修复——CoCl2处理大鼠的HIF-1α、VEGF、runt相关的转录因子2(runt-related transcription factor，2RUNX2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)在mRNA/蛋白质水平表达提高。各类研究表明，Co2+可以通过抑制HIF-PH活性进而显著提高血管生成基因、成骨基因表达和OCN、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的分泌以及类管状细胞网络的形成，从而促进骨修复。

2.1.2 DFO DFO作为常用的HIF-PH抑制剂，体内和体外均可以在不依赖氧浓度的条件下提高HIF-1α表达，促使机体对低氧作出反应。Chen等[13]研究表明，大部分水凝胶纤维支架可在14d内降解完全，并可持续释放DFO 72h，DFO通过Fe2+螯合物作用减弱HIF-PH活性，使得HIF-α表达上调明显增加新血管化、细胞增殖和血管形成。Li等[14]将成熟雄性激素性股骨头坏死(steroid-induced necrosis of the femoral head，ONFH)新西兰白兔随机分为双侧核减压组、局部DFO给药组和对照组，发现DFO组的HIF-1α、VEGF、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、OCN的表达都较其他组高，改善了新生骨体积和血管分布。Jia等[15]将含有DFO的聚乳酸羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)支架移植到严重骨质疏松性股骨缺损/正常人中，发现DFO增强了MSCs的成骨分化，上调了MSCs中血管生成因子的mRNA表达水平，促进了人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的血管生成——DFO通过激活HIF-1α信号通路可促进MSCs的成骨分化和血管生成从而加速骨质疏松性骨缺损的愈合。总之，DFO能够通过Fe2+螯合物作用减弱HIF-PH活性，使得HIF-α表达上调，进一步促进骨修复。

2.1.3 DMOG DMOG能显著增强骨相关基因的表达并促进血管生成活性。Zhu[16]和Ding[17]等发现DMOG通过激活HIF-1α的表达，显著地增加了脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)中VEGF的生成，并提高了ADSCs的成骨分化潜能，增强了ADSCs的血管生成和成骨活性，明显改善了坏死区的血管化和骨再生。Woo等[18]在MC4前成骨细胞中发现，DMOG和丁酸合成产物协同增强前成骨细胞应答和成骨细胞分化，加速骨再生的过程——这主要与α硫酸钙增加了HIF-1α、VEGF、BSP等表达相关。Zhang等[19]在DMOG处理的人类诱导多能干细胞中发现持续激活的HIF-1α，显著增强了人类多功能干细胞-MSCs(human pluripotent stem cells，hiPSC-MSCs)中血管生成相关因子的基因和蛋白表达，这主要与DMOG通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B通路有关。类似地，Peng等[20]发现DMOG增强了MSC成骨分化通过激活HIF-1α从而激活Wnt/β-catenin信号通路来实现。总之，DMOG能够在MBG支架中抑制HIF-PH活性，显著诱导HIF-1α、VEGF和骨相关基因表达，从而促进骨修复。

2.1.4 L-mim L-mim是HIF-PH抑制剂，可以激活HIF-1α通路，从而提供良好的血供和充分的氧气，促进VEGF、成骨相关细胞的表达，进而有效促进骨组织修复。Janjic等[21]对人类牙髓原代细胞进行单层、球状培养来探讨L-mim对牙髓再生的影响，发现L-mim通过激活HIF-1α增加了血管生成素样4(angiopoietin-like 4，Angptl4)、血管生成素在蛋白水平的合成和Angptl4在mRNA水平的表达。Warnecke等[22]在血管生成的海绵模型中，局部反复注射L-mim可显著增加组织由边缘向中心血管化的趋势，体外和体内试验均说明了L-min可通过影响林希氏基因(von Hippel-Lindau，pVHL)来诱导激活HIF-1α促进血管化进而快速适应缺氧环境，为缺损骨组织局部提供良好的血供及营养，可以有效促进骨修复。

2.1.5 铜离子(Cu2+)及其化合物 铜、钴作为第八元素具有类似的化学性质，Cu2+是否具有与Co2+相似的性质引起了广泛关注。Wu等[23]将Cu2+植入大孔和有序中间孔道的MBG中，制备了两种Cu-MBG支架。在人类BMSCs中，发现两种Cu-MBG和它们的离子萃取物均可以刺激HIF-1α和VEGF表达；并改善ALP、OPN和OCN等的表达，促进了人类BMSCs的成骨分化。Zhang等[24]采用粒径约30纳米的结晶氧化铜/氧化亚铜纳米离子得到水溶性石墨烯氧化铜纳米复合材料(GO-Cu)，并将GO-Cu作用于覆盖多孔的磷酸钙支架，制备了表面分布均匀、持续释放Cu2+的复合支架。体外实验表明，GO-Cu涂层增强了大鼠BMSCs的附着力和成骨分化；并通过激活细胞外信号调节酶1/2信号通路上调BMSCs中HIF-1α的表达，从而促进VEGF和BMP-2的分泌，增加了血管生成和成骨形成，进一步促进骨修复。

2.1.6 其他金属离子及其化合物 Xiang等[25]采用铈氧化物纳米颗粒(cerium oxide nanoparticles，CNPs)修饰TEB支架，发现CNPs可以提高细胞增殖和抑制细胞凋亡。细胞膜与纳米粒子表面相互作用可以激活MSCs的钙通道，提高细胞内游离Ca2+含量，增强了HIF-1α的稳定性，进而加强VEGF表达。同时，VEGF旁分泌可以促进内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的增殖、分化和管腔形成，显著改善TEB体内的血管分布。Li等[26]通过加入锂(Li)制作了多孔凝胶/纳米锂-羟基磷灰石/明胶微粒/(Li-nHA/GMs/rhEPO)支架，该支架具有良好的机械抗压强度，能够连续控制Li和重组促人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)的释放，改善糖皮质激素治疗后BMSCs和血管内皮细胞的存活率，增加成骨细胞和血管生成因子的表达，通过激活Wnt信号通路从而上调HIF-1α/VEGF的表达。已知的一些金属离子及化合物可以通过增强并上调HIF-1α的表达，对其下游基因进行调控从而促进骨修复；其他未知的是否也具有类似的功能还有待进一步研究证实。

2.2 基因改造 在骨骼发育的过程中，通过细胞非自治机制激活骨骼模型，可协调骨形成的时间、方向和程度。Chen等[27]将SOX-9基因(sry related high-mobility group box gene-9，SOX-9)转染入三维渐进多孔聚乳酸-聚乙醇酸共聚物PLGA，形成PLGA/Sox-9复合支架，该支架协同上调HIF-1α表达，刺激了ADSCs的软骨分化，从而使得ADSCs获得了与软骨细胞相关的生物学特性。Wang[28]和Wan等[29]研究表明，选择性删除pVHL基因实现了老鼠体内HIF-1α高表达进而促进了VEGF高表达，明显促进了高密度、血管化长骨的形成。Zou等[30]采用基因点突变法将基因Lenti-CA5、Lenti-WT(野生型，HIF-1α)和Lenti-LacZ转染植入大鼠BMSCs中，构造了一种有效的HIF-1α(CA5)的活性形式，并与钙镁磷酸水泥支架结合在一起，以修复大鼠的颅盖骨缺陷。结果表明，HIF-1α的过表达显著促进了成骨标志相关mRNA和蛋白的表达，并发现具有局部高密度的强健新骨形成。最近的实验研究证实，对HIF-1α通过相关的基因或靶点进行基因的敲低或过表达是一种有效的激活HIF-1α手段，但机制有待进一步探讨。

2.3 材料功能性改造 支架自身强度可以保持较高的孔隙度进而对低氧缺氧作出反应，并激活许多支持血管生成的基因[10]。有序的介孔通道结构和高比表面能够有效地传输抗生素药物进而提高抗生素的生物利用率[11，28]。材料不同的MBG支架可以通过化学键作用实现对HIF-PH抑制剂的持续释放来降低细胞毒性、延长其半衰期，激活HIF-1α并诱发后续的血管生成。同时，3D打印技术通过对生物材料的分层精确堆积可以控制外形、调节内部孔隙结构、大小、分布达到有利于骨形成的效果和解决移植的孔隙率和血管化问题。Zhang等[31]通过3D打印和旋转涂层成功制备的介孔MBG修饰-β-磷酸三钙(MBG-β-TCP)支架，具有分层孔隙结构和功能支撑表面，明显增强MBG-β-TCP支架的抗压强度和矿化能力。试验结果表明，该复合支架可提升兔BMSCs的成骨相关基因表达和蛋白分泌；同时也可以提高了HUVECs的附着和血管生成相关基因表达。总之，材料功能性改造可以激活HIF-1α和其他相关基因的表达，进而促进骨修复。

2.4 中医药 最近研究发现，中医药可以激活HIF-1α从而影响缺血性相关疾病的发生、发展。红景天[32]激活HIF-1α进而诱导EPO表达来调节机体对缺氧的反应；木通皂苷[33]上调HIF-1α/VEGF通路促进血管生成和伤口愈合；梓醇和葛根素[34]上调细胞外蛋白调节激酶/磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白/HIF-1α信号通路来达到减少梗死体积、保护血管完整性和抑制内皮细胞凋亡的效果；芪参益气滴丸[35]能够下调miR-223-3p从而抑制核糖体S6蛋白激酶抗体/HIF-1α信号通路来促进缺血心肌血管生成的能力。随着研究的进一步深入，HIF-1α的作用也不断被阐释。Wu等[36]在探讨再生障碍性贫血患者的骨髓间血管生成的差异时，发现“阴虚证”患者与“阳虚证”患者相比，VEGF和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)表达降低，而HIF-1α表达升高。Yuan等[37]在研究补肾通络汤对血管生成和骨吸收的影响时，发现补肾通络汤显著降低了在股骨干骺端降钙素受体和组织蛋白酶K的mRNA和蛋白水平，并抑制了卵巢切除大鼠的骨吸收。在动物模型中，补肾通络汤降低了骨质疏松症的破骨细胞活化和骨吸收主要与激活HIF-1α增加VEGF表达进而促进血管生成功能和抑制NF-κB配体(RANKL/OPG)信号通路有关。中医药在促进骨修复自古有之，近代研究发现激活HIF-1α通路是中医药促进骨修复有利证据，但这只是作用机制中的冰山一角，更多的作用途径有待挖掘。

3 结论与展望

组织工程骨可以通过激活HIF-1α改善其血液灌注不足进而促进骨代谢/修复。HIF-HP抑制剂、基因改造、材料粒径、结构改变、功能性表面修饰和中医药的使用等均可激活HIF-1α，从而促进一系列血管生长因子的表达，通过改善血管舒张、血管渗透性、内皮细胞出芽、增殖、迁移等方式促进骨再生。HIF-PH抑制剂激活HIF-1α通路目前研究最为普遍，但存在着作用机制不全面、系统性不强和临床证据不足的缺陷；同时基因改造技术作为前沿技术有待进一步研究和临床验证。

复合骨支架通过激活HIF-1α促进骨修复只是骨组织工程的一种途径，但其过程却涵盖了骨修复和成血管化的多个方面，其作用十分关键。根据骨损伤的具体情况和患者的经济情况选择合适的生物支架，骨损伤有望做到个性化的治疗，因人制宜。传统中医药具有精准医学和个性化治疗的显著特点，目前研究从一定程度上揭示了其可以激活HIF-1α促进骨代谢，但中医药治疗存在临床应用实例不足等问题、以及在对激活HIF-HP抑制剂从而诱导HIF-1α的表达的作用机制方面仍不明确，这可以作为未来研究的重要切入点。