肝癌细胞HepG2与QGY7701摄取99Tcm-AMD3100与18F-FDG的对比研究

何婷婷，王卉，田嘉禾，张锦明*

1.解放军总医院海南分院核医学科，海南三亚 572013；2.解放军总医院核医学科，北京 100853； *通讯作者 张锦明zhangjm301@163.com

原发肝癌的早期诊断、治疗和治疗后的及时随访对提高患者的生存率有非常重要的意义。近年来PET/CT显像在肝癌诊断中得到广泛应用，其中广谱类的肿瘤显像剂主要是18氟-氟代脱氧葡萄糖（18F-fluoro-2-deoxyglucose，18F-FDG），其肿瘤摄取和治疗后预后相关[1]。然而PET显像费用昂贵不易普及。而相对廉价的单光子发射计算机断层成像术（single-photon emission computed tomography，SPECT）在肝癌诊断上尚无理想的肿瘤显像剂。趋化因子受体-4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）是G蛋白偶联受体蛋白家族的一员，与基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor 1，SDF-1），也称C-X-C motif chemokine 12（CXCL12）相互作用后启动下游信号通路形成 SDF-1/CXCL12/CXCR4生物轴，在肝癌侵袭转移过程中发挥重要作用[2]。本文拟通过99Tcm标记的CXCR4特异性拮抗剂AMD3100，对2株肝癌细胞HepG2和QGY7701的摄取特征进行初步研究，并与18F-FDG进行比较，以探讨99Tcm-AMD3100 SPECT显像能否在体评估肝癌细胞CXCR4的表达，并帮助判别肝癌细胞的侵袭及转移能力。

1 材料与方法

1.199Tcm-AMD3100与18F-FDG的制备与质量控制AMD3100由Sigma公司提供，采用配体转移法，先制备99Tcm-GH（MDP）等中间转移配体，再由AMD3100与之竞争以制备最终产品。标记完毕后将示踪剂的比活度稀释调整为3.7~7.4 MBq/0.5 ml备用。放化纯>90%方可使用。18F-FDG由解放军总医院放射性药物合成中心提供，依照说明书制备和质量控制。制成比活度为 3.7~7.4 MBq/0.5 ml（37 GBq/L）的18F-FDG溶液备用。

1.2 细胞培养 人类肝癌细胞株HepG2与QGY7701（中国医学科学院上海细胞库）在含10%的优级胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中（PAA公司），于37℃、5% CO2培养箱内培养。硝酸纤维素膜购自普利来基因技术有限公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；AMD3100购自Sigma公司。

1.3 细胞侵袭及迁移实验 将Matrigel放在冰上然后放入冰箱中隔夜使其解冻，与无血清DMEM按1∶1混合，取24孔板，每孔加入40 µl，置37℃使其凝聚成胶状。迁移实验中滤膜无需铺胶，余步骤与Matrigel侵袭实验相同。在24孔板中加入含10%小牛血清的细胞培养液，将细胞悬液加入Transwell小室中，每小室200 µl，每种细胞重复3孔，将小室浸于24孔板的完全培养液中，37℃、5% CO2培养箱内孵育24 h，取出小室，去掉上层小室中的培养液，并用棉棒仔细去除上层小室侧的未迁移细胞和Matrigel。小室外侧细胞用0.1%结晶紫染色20 min，用PBS清洗3遍。镜下观察迁移杯底面细胞。在显微镜下拍照。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上562 nm测其OD值，间接反映细胞数。

1.4 肝癌细胞CXCR4mRNA水平检测 根据GenBank中CXCR4 cDNA的序列设计引物，上游引物：5’-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3’，下游引物：5’-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3’，产物大小为302 bp。内参照GAPDH：上游引物：5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物：5’-CCACTGACACGTTGGCAGTG-3’，产物大小为275 bp。取对数生长期肝癌细胞，采用Trizol法提取细胞的总RNA，用RNase-freeDNase I处理后进行RT-PCR。PCR反应体系：模板1 µl；上游引物1 µl；下游引物1 µl；2×Tag PCR MasterMix 12.5 µl；H2O 9.5 µl；总体积25 µl。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物采用凝胶图像扫描仪拍照并用Image J软件进行条带灰度分析，以CXCR4/GAPDH的比值代表其相对表达量，每个条带测量3次。

1.5 体外肝肿瘤细胞99Tcm-AMD3100摄取实验 ①将2株肝癌细胞分别接种于6孔板，待细胞生长至80%左右，实验前更换新鲜培养基。取示踪剂用PBS液稀释，PBS液用量根据计数进行调整，取稀释后示踪剂液30~100 µl加入空白小试管中，置入井型γ-计数仪中计数，使计数稳定在100 000以下。分别孵育30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，每组均设3个复孔。②每组孵育结束时，培养孔用PBS洗涤细胞3次，0.25%胰酶消化2 min，用1.5 ml含10%FBS的RPMI 1640培养液终止消化。③收集全部细胞悬液放入小管中，γ-计数器测定每个小管中细胞的放射性计数并记录，计算每1×106个细胞的放射性活度，并进行细胞计数。④数据校正计算公式。细胞摄取率计算：%ID/106=实验计数/空白管计数×100%/细胞计数（单个细胞的示踪剂摄取量与加入示踪剂总量的比值）。方法同上计算2株细胞对18F-FDG的摄取。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0软件，计量资料均以±s表示，比较采用方差分析或t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2株肝癌细胞体外迁移及侵袭能力比较 迁移实验中见较多HepG2细胞和QGY7701细胞穿越滤膜，镜下显示HepG2穿越细胞数多于QGY7701，HepG2的 OD 值（1.243±0.100）高于 QGY7701（1.170±0.155），差异无统计学意义（P>0.05）；侵袭实验中见部分细胞穿越基质胶和滤膜，HepG2的 OD值（0.433±0.025）高于 QGY7701（0.347±0.032），差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 肝癌细胞 CXCR4mRNA 水平检测 HepG2、QGY7701肝癌细胞系均存在CXCR4mRNA水平的表达（图1），相对表达量分别为 0.888±0.048、0.786±0.027，HepG2细胞CXCR4mRNA表达明显高于QGY7701，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 HepG2和QGY7701细胞的CXCR4mRNA表达水平，*P<0.05

2.3 2株肝癌细胞99Tcm-AMD3100和18F-FDG摄取率比较 2株肝癌细胞对于99Tcm-AMD3100及18F-FDG的摄取率见表1、2，99Tcm-AMD3100在2株肝癌细胞中摄取率呈波动式上升。18F-FDG的摄取率均随时间的延长而持续增加。2株肝癌细胞在15 min、30 min、60 min及360 min时，HepG2的99Tcm-AMD3100摄取率高于QGY7701，其中60 min摄取率差异有统计学意义（P<0.05），而在120 min及180 min时，QGY7701的99Tcm-AMD3100摄取率高于 HepG2，差异无统计学意义（P>0.05）。在 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min 6个时间点，HepG2的18F-FDG摄取率均高于QGY7701，其中30 min、120 min及150 min时2株细胞18F-FDG的摄取率差异有统计学意义（均P<0.05）。2株细胞对18F-FDG摄取较快，摄取率更高，而99Tcm-AMD3100的摄取率偏低，且2株细胞间变化较小。同一株细胞在不同时间点18F-FDG的摄取率均高于99Tcm-AMD3100，其中120 min和180 min时，HepG2细胞中18F-FDG 的摄取率明显高于99Tcm-AMD3100，差异有统计学意义（均P<0.05），而在30 min和120 min时，QGY7701细胞中18F-FDG的摄取率明显高于99Tcm-AMD3100，差异有统计学意义（均P<0.05），见图2。

3 讨论

表1 2株肝癌细胞不同时间点99Tcm-AMD3100摄取率的比较（n=3）

表2 2株肝癌细胞不同时间点18F-FDG摄取率的比较（n=5）

图2 18F-FDG及99Tcm-AMD3100在HepG2或QGY7701细胞中摄取率的比较，*P<0.05

趋化因子主要参与调节感染、炎症以及组织修复相关的免疫反应，并且在胚胎形成阶段调控多种细胞的迁移。目前已经发现46种趋化因子和18种趋化因子受体[3]。其中 CXCR4属于特异性趋化因子受体，在多种不同类型肿瘤中均有表达，在侵袭、转移中发挥重要作用[2,4-5]。有研究表明，CXCR4高表达的肿瘤病情进展快且预后不良，在 CXCL12/CXCR4表达与患者预后相关的肿瘤研究中，高表达CXCL12的组织形成的远处转移灶是此类肿瘤患者的主要死亡原因[6-7]。而AMD3100作为强效、选择性非肽类趋化因子CXCR4受体拮抗剂，能与SDF-1竞争结合CXCR4，能抑制大多数恶性肿瘤，对肿瘤起治疗作用。研究表明，金属离子Cu2+、Zn2+等与AMD3100络合后其与CXCR4的亲和性提高了数十倍，这为AMD3100用于广谱类恶性肿瘤显像提供了可能[8]；但64Cu本身会分解聚集于肝脏内造成肝脏本底摄取增高。因此本研究选择99Tcm-AMD3100作为CXCR4受体显像剂。该示踪剂具备高靶本比的同时，肝脏摄取明显减低，适用于肿瘤CXCR4受体的活体化研究[9]。既往CXCR4受体探针的研究主要集中在药代动力学、药物体外生物学分布及毒性试验方面[8-9]。经研究证实，CXCR4高表达的肿瘤细胞及动物模型能特异性摄取CXCR4探针；还有部分研究将该类探针用于某些肿瘤（如小细胞肺癌、脑胶质母细胞瘤）活体显像，发现CXCR4高表达的活体肿瘤组织均存在不同程度CXCR4探针的摄取，且与肿瘤组织 CXCR4表达高低有一定相关性，但部分CXCR4高表达的肿瘤无显著放射性浓聚，考虑可能与该受体的动力学特征及内化有关[10-11]；且该类临床研究例数有限，同时CXCR4受体探针浓聚程度受多种因素影响，如治疗方案及化疗药物等。

本研究在制备99Tcm-AMD3100的基础上，选取了组织来源不同的2株肝癌细胞，通过RT-PCT法检测CXCR4mRNA的差异性表达，判断细胞体外迁移及侵袭能力大小，同时利用99Tcm-AMD3100进行细胞核素摄取实验，并与经典肿瘤显像剂18F-FDG进行对比，研究其CXCR4的表达与细胞迁移、侵袭能力及摄取率之间的关系。实验证明，所选2种肝癌细胞均不同程度地表达CXCR4，其mRNA表达水平与2株肝癌细胞侵袭能力呈正相关趋势，王勃等[12]在研究中同样发现CXCR4高表达的肝癌细胞其转移潜能高于低转移潜能肝癌细胞，提示CXCR4可能是肝癌侵袭转移过程中的关键因子。同时本实验中CXCR4高表达的HepG2细胞，其99Tcm-AMD3100和18F-FDG摄取率明显高于QGY7701，提示肝癌细胞中CXCR4mRNA表达与CXCR4受体探针、18F-FDG摄取值呈正相关趋势，与既往文献报道[13]基本一致，但同一株细胞内99Tcm-AMD3100的摄取率明显低于18F-FDG。Vag等[13]在研究中也发现同一肿瘤组织中68Ga-pentixafor（CXCR4受体探针）摄取值偏低，考虑是由于该探针结合位点在细胞质，而通过转录或蛋白水平 CXCR4的表达则位于细胞表面造成，认为CXCR4受体探针可能更适用于某些特殊类型肿瘤显像（如多发性骨髓瘤）。尽管HepG2细胞的CXCR4mRNA表达明显高于 QGY7701，但在不同时间点 2株肝癌细胞99Tcm-AMD3100摄取率高低略有不同，提示2株肝癌细胞99Tcm-AMD3100体外摄取动力学特点与18F-FDG略有不同，而HepG2不同时间点的99Tcm-AMD3100平均摄取率高于QGY7701，与2株肝癌细胞CXCR4mRNA表达呈正相关趋势，同时侵袭力高的 HepG2细胞的99Tcm-AMD3100和18F-FDG摄取率均高于侵袭力低的QGY7701细胞，提示99Tcm-AMD3100和18F-FDG摄取率均可作为判定细胞侵袭力高低的指标之一。

本研究通过不同生物学特性肝癌细胞初步观察了99Tcm-AMD3100的体外摄取动力学特征，并与18F-FDG进行比较，尽管99Tcm-AMD3100体外摄取率低于18F-FDG，且随时间变化差异较大，但2株肝癌细胞99Tcm-AMD3100摄取率与CXCR4表达及侵袭能力呈正相关趋势，提示99Tcm-AMD3100可作为一种特异性强的新型肿瘤显像剂用于肝癌研究，但本文仅从细胞水平初步评估CXCR4受体表达与相关探针的相互关系，还需通过动物模型及活体显像进一步验证两者之间的相关性。

[1]Lee JW, Oh JK, Chung YA, et al. Prognostic significance of18F-FDG uptake in hepatocellular carcinoma treated with transarterial chemoembolization or concurrent chemoradiotherapy: a multicenter retrospective cohort study.J Nucl Med, 2016, 57(4): 509-516.

[2]Ghanem I, Riveiro ME, Paradis V, et al. Insights on the CXCL12-CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma carcinogenesis. Am J Transl Res, 2014, 6(4): 340-352.

[3]Zlotnik A, Yoshie O, Nomiyama H. The chemokine and chemokine receptor superfamilies and their molecular evolution.GenomeBiol, 2006, 7(12): 243.

[4]Ping YF, Yao XH, Jiang JY, et al. The chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 promote glioma stem cell-mediated VEGF production and tumour angiogenesis via PI3K/AKT signalling. J Pathol, 2011, 224(3): 344-354.

[5]Hu F, Miao L, Zhao Y, et al. A meta-analysis for C-X-C chemokine receptor type 4 as a prognostic marker and potential drug target in hepatocellular carcinoma. Drug Des DevelTher, 2015, 15(9): 3625-3633.

[6]Wu W, Qian L, Chen X, et al. Prognostic significance of CXCL12, CXCR4, and CXCR7 in patients with breast cancer. Int J ClinExpPathol, 2015, 8(10): 13217-13224.

[7]Cai C, Wang LH, Dong Q, et al. Association of CXCL12 and CXCR4 gene polymorphisms with the susceptibility and prognosis of renal cell carcinoma. Tissue Antigens, 2013,82(3): 165-170.

[8]Gerlach LO, Jakobsen JS, Jensen KP, et al. Metal ion enhanced binding of AMD3100 to Asp (262) in the CXCR4 receptor. Biochemistry, 2003, 42(3): 710-717.

[9]Hartimath SV, Domanska UM, Walenkamp AM, et al.[99mTc]O2-AMD3100 as a SPECT tracer for CXCR4 receptor imaging. Nucl Med Biol, 2013, 40(4):507-517.

[10]Lapa C, Lueckerath K, Kleinlein IA, et al. 68Ga-Pentixafor-PET/CT for imaging of chemokine receptor 4 expression in glioblastoma. Theranostics, 2016, 6(3): 428-434.

[11]Lapa C, Lueckerath K, Rudelius M, et al. [68Ga]Pentixafor-PET/CT for imaging of chemokine receptor 4 expression in small cell lung cancer--initial experience. Oncotarget, 2016,7(8): 9288-9295.

[12]王勃, 李少林, 张俊, 等. CXCR4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达及意义. 中国医科大学学报, 2012, 41(2): 131-134, 138.

[13]Vag T, Gerngross C, Herhaus P, et al. First experience with chemokine receptor CXCR4-targeted PET imaging of patients with solid cancers. J Nucl Med, 2016, 57(5): 741-746.