金鱼卵黄原蛋白单抗夹心ELISA的开发及其在环境雌激素检测中的应用❋

马淑伟，王 军，单瑞后，张振忠，汝少国

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

鱼类卵黄原蛋白(vitellogenin, Vtg)是目前检测环境雌激素活性最常用的生物标志物，其测定通常采用基于Vtg或卵黄脂磷蛋白(lipovitellin, Lv)多克隆抗体建立的酶联免疫吸附方法(ELISA)[1-2]。与多克隆抗体相比，单克隆抗体识别单一抗原表位，具有更高的特异性，利用单克隆抗体建立的ELISA能显著提高检测的精确度，可以更加准确地定量Vtg[3-4]。然而，单克隆抗体的制备成本高，技术难度大，目前只开发了青鳉(Oryziaslatipes)、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)等几种鱼类的Vtg或Lv单克隆抗体[3,5-6]。金鱼(Carassiusauratus)是环境雌激素研究常用的受试生物[2,7]，研究者已经利用多克隆抗体建立了金鱼Vtg的ELISA[8-9]，但是至今未见金鱼Vtg单抗ELISA的报道。同科鱼类的Vtg具有相近的免疫源性，能被同科鱼类Vtg抗体识别，例如鲤鱼(Cyprinuscarpio)Vtg多克隆抗体常被用于检测黑头呆鱼(Pimephalespromelas)和金鱼等鲤科鱼类的Vtg[1,10]，推测单克隆抗体也可以检测同科鱼类的Vtg。因此，本研究尝试利用实验室制备的斑马鱼Lv单克隆抗体[11]建立金鱼Vtg的ELISA。

鱼类Vtg ELISA建立后需要开展17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)或其它雌激素类物质的暴露实验，以检验方法的可靠性[12]。血浆是检测Vtg常用的样品[2,13]，但是血样采集过程会对鱼体造成伤害甚至死亡。随着人们对动物保护与福利的日益关注，开发无伤害的检测方法引起了研究者的关注。Moncaut等[14]提出南美鲷鱼(Cichlasomadimerus)体表粘液中含有Vtg，可以用作检测样品。因此，本研究利用建立的单抗夹心ELISA测定了E2暴露后金鱼血浆和体表粘液中的Vtg含量，评价了以金鱼体表粘液代替血浆，用于Vtg检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

金鱼购自青岛市南山花鸟虫鱼市场，体重(21.6±3.6) g、体长(9.4±0.6) cm，实验室驯养两周后用于实验。实验容器为50 L玻璃水族箱，实验用水为连续曝气24 h的自来水，溶解氧为(7.0±0.1) mg·L-1，光周期(光暗比)为16∶8，每天饲喂适量金鱼颗粒饵料。

1.2 金鱼Vtg与Lv的纯化

金鱼Vtg与Lv的提取和纯化采用此前实验室报道的两步层析法[15]。

1.3 单克隆细胞株的筛选

将对照雄鱼血浆、E2诱导雄鱼血浆、纯化的金鱼Vtg进行SDS-PAGE，将蛋白转印到PVDF膜，封闭后，利用8株斑马鱼Lv单克隆抗体室温孵育4 h；TBST洗3次后，用辣根过氧化物酶标记羊抗兔LgG室温孵育4 h，TBST洗膜3次后，用DAB显色液显色，待条带清晰时，用蒸馏水终止反应。将筛选出的杂交瘤细胞株进行扩大培养。

1.4 抗体的生产与纯化

参照An等[6]的方法制备大量单克隆抗体。向小鼠腹腔注射杂交瘤细胞105个；10 d后取腹水，收集上清，纯化单克隆抗体。利用Bradford法测定蛋白浓度，保存于-80 ℃。

1.5 夹心ELISA的建立与性能评价

参考Mitsui等[16]的方法，将纯化的斑马鱼Lv单克隆抗体用碳酸钠包被缓冲液(0.05 Mol/L, pH 9.6)稀释至5 μg·mL-1后，4℃包被过夜；次日，37 ℃封闭1 h，用PBST清洗3次后，加入100 μL梯度稀释的纯化金鱼Lv，37 ℃孵育1 h，随后加入100 μL不同稀释倍数的HRP-标记金鱼Lv多克隆抗体(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000)，于37°C孵育1 h；最后，加入100 μL TMB单组分显色液(Solarbio, China)，37 ℃显色10 min，用2N H2SO4终止反应，测定450 nm下的吸光值。

参照Nilsen等[17]与Maltais等[18]的方法测定ELISA的精确度与检出限。精确度通过组内差异与组间差异评价，检出限定义为12个0标准品孔吸光值的平均值加上两倍标准差所对应的标准品浓度。

1.6 E2对金鱼Vtg的诱导

采用半静态毒性试验方法，E2暴露浓度分别为0、10、100和1 000 ng·L-1，3、21 d后采集血样与体表粘液。体表粘液的采集按照Maltais和Roy[19]的方法略加修改，用刀片轻轻擦拭金鱼尾鳍，将刀片上粘液转移至1.5 mL离心管中，称重，按1∶10(w∶v)加入预冷的含有抑酶肽(0.05 IU·mL-1)的0.01 mol/L PBS (pH 7.4)，匀浆后，4℃ 8 000 g离心10 min，取上清。利用Western blot和ELISA检测血浆与体表粘液中的Vtg。

1.7 数据分析

金鱼(n=6)血浆与体表粘液中Vtg含量经Tukey’s检验后进行单因素方差分析(ANOVA)。所有数据以平均值±标准差的形式表示，当P<0.05时，定为差异显著，P<0.01时，定为差异极显著。数据统计检验采用SPSS软件(version 18)进行。

2 结果

2.1 单克隆细胞株的筛选与抗体获取

Western blot结果显示，H2H6、H1C8、H4C11、H3A8检测到纯化Vtg与E2诱导组雄鱼血浆的多条清晰条带，但与对照雄鱼血浆不发生交叉反应(见图1)。将这4株细胞扩大培养后，利用Protein G纯化获得了H2H6、H1C8、H4C11、H3A8单克隆抗体的IgG组分。

(1：纯化的Vtg；2：E2诱导组雄鱼血浆；3：对照组雄鱼血浆。1: purified Vtg; 2: E2-induced male plasma; 3: control male plasma.)

图1 Western blot测定斑马鱼Lv单克隆抗体对金鱼Vtg的特异性
Fig.1 Specificity ofanti-zebrafish Lvmonoclonal antibodies to goldfish Vtg by Western blot analysis

2.2 夹心ELISA的建立

以纯化的4种单抗分别包被酶标板，以HRP标记的金鱼Lv多抗(稀释倍数为10 000倍)为检测抗体建立了夹心ELISA。以单抗H2H6与H4C11包被时，金鱼Lv标准品的吸光值很低，且不呈线性；在利用单抗H3A8与H1C8建立的ELISA中，金鱼Lv的吸光值较高，具有较好的线性，相比之下，在基于单抗H3A8建立的夹心ELISA中Lv曲线的斜率更大(见图2)。

当单抗H3A8包被浓度为5 μg·mL-1时，不同稀释倍数HRP标记抗体获得的曲线如图3A所示。当HRP标记抗体稀释1∶10 000时，曲线具有很宽的工作范围，呈现较好的线性，并且最大吸光值在3.0左右，在该反应条件下，ELISA的工作范围为15.6～1 000 ng·mL-1(y=1.664 9x-2.106 2，R2=0.990 4)，检出限为9.6 ng·mL-1(见图3B)。

图2 利用夹心ELISA筛选单克隆抗体Fig.2 Screening monoclonal antibody by sandwich ELISA

图3 HRP标记抗体稀释倍数的确定(A)与夹心ELISA的标准曲线(B)Fig. 3 Determination of the optimal dilution of HRP-labeled antibody (A) and a standard curve of sandwich ELISA (B)

利用单抗H3A8建立的夹心ELISA同时检测了纯化的金鱼Vtg与Lv，发现它们的标准曲线几乎重合(见图4)。

图4 金鱼Vtg和Lv免疫同源性检测Fig. 4 Test of immunologic similarities between goldfishVtg and Lv

利用Lv标准品测定了ELISA的精确度。其组内差异为1.30%～4.99%，组间差异为2.30%～4.37%(见表1)，均低于5%。

表1 ELISA组内差异与组间差异的测定

2.3 E2暴露对金鱼血浆与体表粘液Vtg的诱导

2.3.1 E2暴露3 d Western blot结果显示，单抗H3A8在对照组、10和100 ng·L-1E2暴露3 d后的雄鱼血浆、体表粘液均未检测到Vtg条带；在1 000 ng·L-1暴露组雄鱼血浆、体表粘液均检测到两条与纯化Vtg相同的条带(见图5)。

(1：对照组；2：10 ng·L-1组；3：100 ng·L-1组；4：1000 ng·L-1组；5：纯化的金鱼Vtg。Land 1: control; land 2: 10 ng·L-1; land 3: 100 ng·L-1; land 4: 1 000 ng·L-1; land 5:purified goldfishVtg.)

图5 Western blot检测E2暴露3 d后雄鱼血浆(A)和体表粘液(B)中的Vtg.
Fig.5 Vtg inductionin plasma(A)and surface mucus(B) of male goldfish exposed to E2for 3 days detected by Western blot

对照组、10 ng L-1和100 ng L-1E2暴露3 d后的雄鱼血浆和体表粘液均未检测到Vtg，1 000 ng L-1暴露组雄鱼血浆和体表粘液中Vtg含量分别为(168.5±32.2) μg·mL-1和(9.9±1.7)μg·mL-1，显著高于对照组(P<0.01，见图6)。

2.3.2 E2暴露21 d Western blot结果显示，对照组与10 ng·L-1E2暴露21 d后的雄鱼血浆和体表粘液未检测到Vtg条带，100 ng·L-1E2暴露组雄鱼血浆检测到两条带，1 000 ng·L-1E2暴露组出现了多条清晰条带(见图7A)。100和1 000 ng·L-1E2暴露组雄鱼体表粘液检测到2条清晰条带及1条较弱条带(见图7B)。

ELISA结果显示，对照组与10 ng·L-1E2暴露组雄鱼血浆和体表粘液中未检测到Vtg，100与1 000 ng·L-1E2暴露后雄鱼血浆Vtg含量显著升高至(14.6±4.7)、(1 216.0±525.2)μg·mL-1(P<0.01，见图8A)。100与1 000 ng·L-1暴露组雄鱼体表粘液中的Vtg含量显著升高至(17.2±0.2)、(288.53±125.6)μg·mL-1(P<0.01，见图8B)。

图6 利用ELISA测定不同浓度E2暴露3 d后雄性金鱼血浆(A)和体表粘液(B)中的Vtg浓度Fig. 6 Vtgconcentrations in plasma (A) and surface mucus(B) of male goldfishexposed to different E2for 3 daysdetected by ELISA.

3 讨论

本研究利用斑马鱼Lv单克隆抗体建立了金鱼Vtg的夹心ELISA，为金鱼Vtg的检测提供了新的方法。Western blot结果显示，单抗H2H6、H1C8、H4C11、H3A8能够检测到E2诱导组雄鱼血浆与纯化Vtg的阳性条带，但是与对照组雄鱼血浆无交叉反应，表明它们对金鱼Vtg具有很高的特异性，这与斑马鱼Vtg的研究结果相近[20]；并且金鱼Vtg在以上4种单抗的检测下都显示一条清晰的主带与多条弱带，这与金鱼Vtg多克隆抗体的Western blot结果相一致[21]，表明斑马鱼Lv单抗能够识别金鱼Vtg的多个亚基，可以用于金鱼Vtg的检测。ELISA的结果显示单抗H3A8对金鱼Lv具有更宽的检测范围，且斜率明显高于其它抗体，表明该抗体对金鱼Lv具有更高的亲和力。以单抗H3A8为包被抗体，以纯化的金鱼Lv为标准品，以HRP标记金鱼Lv多克隆抗体为检测抗体建立了夹心ELISA，发现金鱼Vtg与Lv的标准曲线几乎完全重合，可见单抗H3A8对金鱼Vtg与Lv具有相同的结合能力；ELISA的组内与组间差异均低于5%，低于金鱼Vtg多克隆抗体建立的ELISA方法[21]，表现出很高的精确度。以上结果证实基于斑马鱼Lv单克隆抗体建立的夹心ELISA能够准确定量金鱼Vtg。本研究建立的ELISA工作范围为15.6～1 000 ng·mL-1，检出限约为9.6 ng·mL-1，与鲤鱼和纹鳢(Channastriata)等鱼类Vtg ELISA的研究结果相近[22-23]， 但是高于金鱼Vtg多克隆抗体建立的ELISA[21]。为进一步提高检测方法的敏感度，今后有必要开发金鱼Vtg的单克隆抗体。

(1：对照组；2：10 ng·L-1组；3：100 ng·L-1组；4：1 000 ng·L-1组；5：金鱼Vtg。Land 1: control; land 2: 10 ng·L-1; land 3: 100 ng·L-1; land 4: 1 000 ng·L-1; land 5: goldfish Vtg.)

图7 Western blot检测E2暴露21 d后雄鱼血浆(A)和体表粘液(B)中的Vtg
Fig.7 Vtg induction in plasma (A)and surface mucus (B) of male goldfish exposed to E2for 21 days detected by Western blot

有研究报道鱼类血浆与体表粘液中的Vtg含量在外源雌激素的诱导下存在正相关性[18,24]，并且鱼类体表粘液取样较血浆取样方便，对鱼体没有伤害，更适合用作Vtg的检测样品[24-25]。为检验金鱼体表粘液中的Vtg是否能够有效指示外源化合物的雌激素活性，本研究利用建立的ELISA测定E2暴露后雄性金鱼血浆和体表粘液中的Vtg含量。E2的环境浓度通常在5～199.0 ng/L之间[26-27]，本研究据此设计了E2的暴露浓度为10、100与1 000 ng·L-1。检测结果显示，100与1 000 ng·L-1E2暴露21 d能诱导雄性金鱼血浆产生Vtg，这与E2对斑马鱼Vtg的诱导结果相一致[28]，证明基于斑马鱼Lv单抗建立的ELISA能够用于检测外源化合物对金鱼的雌激素活性。此前，有研究报道腹腔注射E2能够诱导雄性罗非鱼(Oreochromismossambicus)和金鱼体表粘液产生Vtg[21,29]。本研究在1 000 ng·L-1E2暴露3 d、100和1 000 ng·L-1E2暴露21 d后雄鱼体表粘液检测到了Vtg，表明E2水体暴露同样会诱导金鱼体表粘液生成Vtg。在1 000 ng·L-1E2暴露3 d时，雄鱼血浆中Vtg含量远高于体表粘液，约为体表粘液Vtg含量的17倍，但是100 ng·L-1E2暴露21 d后雄鱼血浆中Vtg的含量是体表粘液的1.2倍，可见在外源化合物质长期暴露下，体表粘液与血浆中的Vtg含量更为接近，可以有效指示外源化合物的雌激素活性。

图8 利用ELISA测定不同浓度E2暴露21 d后雄鱼血浆(A)和体表粘液(B)的Vtg浓度Fig.8 Vtg concentrations in plasma (A) and surface mucus (B) of male goldfish exposed to different E2 for 21 days detected by ELISA

综上，本研究首次建立了金鱼Vtg的单抗夹心ELISA，并且发现金鱼体表粘液Vtg可以用作环境雌激素的无伤害检测指标，为金鱼Vtg指标在环境雌激素研究中应用提供了重要的方法学参考。

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