SLE合并SONFH患者血清差异表达蛋白筛查

赖崇荣，曾平，刘雄，陈金龙，范思奇，秦刚，周怡，廖小波，何凯毅，刘明伟，周艳琼，黄碧秋

(1广西中医药大学，南宁530001；2广西中医药大学第一附属医院；3广西医科大学)

目前，激素性股骨头坏死(SONFH)确切的发病机制仍未彻底阐明，其早期诊断与治疗仍然缺乏特异的生物学标志物，是骨科领域的常见疑难疾病[1]。蛋白质组学技术为SONFH疾病机制的阐明、早期诊断与治疗提供了理论依据及解决方法。目前，SONFH的蛋白质组学研究尚处在起步阶段，使用类固醇皮质激素(GC)后发生SONFH的蛋白质组学研究鲜有报道。本研究以血清差异蛋白质组学作为切入点，以SLE合并SONFH患者作为研究对象，采用同位素相对标记与绝对定量技术(TMT)联合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)，筛查用于阐明SONFH发病机制的血清特异性蛋白标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年4月～2016年6月广西中医药大学第一附属医院临床收治的SLE合并SONFH患者10例(SONFH组)，均为女性，年龄(43.50±7.32)岁，国际骨循环学会分期Ⅱ期2例、Ⅲ期3例、Ⅳ期5例。纳入标准：符合SLE的诊断标准[2]；符合SONFH的诊断标准[3]；满足GC的服用条件及服用总量(3个月内)≥2 000 mg强的松、连续服用时间≥1个半月[4]。另选健康志愿者5例作为对照组，均为女性，年龄(42.00±6.16)岁。两组性别、年龄均具有可比性。

1.2 血清样品采集 清晨抽取两组空腹肘静脉血10 mL，置于枸橼酸钠采血管，于4 ℃冰箱放置1～2 h，3 000 g 离心 10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 血清差异表达蛋白筛查 蛋白提取及酶解：按照 ProteoExtracrTM试剂盒操作说明书去除血清中的高丰度蛋白，洗脱液加入5倍体积丙酮，-20 ℃沉淀3 h，离心后晾干蛋白沉淀块，加入适量Resolution Buffer复溶血清蛋白。用Bradford法测定蛋白浓度。取蛋白样品100 μg，用8 mol/L Urea buffer调整体积。加入终浓度10 mmol/L二硫苏糖醇于37 ℃孵育45 min，再加入终浓度25 mmol/L碘乙酰胺室温避光孵育55 min，用三乙胺-碳酸缓冲溶液(TEAB)稀释Urea后进行酶解。根据质量比1∶50加入trypsine，37 ℃酶解过夜，再次按质量比1∶100加入trypsine，37 ℃二次酶解4 h。采用TMT联合2D-LC-MS/MS进行检测。肽段标记：Strata X C18(Waters公司提供)对酶解后的蛋白样品进行脱盐处理，按照TMT Kit Protocol对肽段进行标记。将除盐后的肽段溶于100 mmol/L TEAB，乙腈41 μL溶解TMT试剂(0.8 mg)，并与肽段100 μg合并后室温反应1 h，加入羟胺终止标记反应，合并各组样品后真空干燥。肽段组分分离：分别将两组标记肽段使用Waters HPLC e2695/2998色谱仪(Waters公司)，用高pH C18 RP色谱柱(Thermo公司)进行馏分分离。待收集的肽段流出组分后，真空抽干，合并成8个组分，分别将每个组分溶于nanoLC A 液20 μL，进样2 μL，经上样柱上样后通过分析柱梯度洗脱，用Orbitrap Elite组合式质谱仪进行鉴定。用Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific)软件将Orbitrap Elite对肽段鉴定的原始图谱文件(.raw文件)转化为.mgf文件，用MASCOT2.3.0服务器于数据库中检索。通过MASCOT服务器上形成的查库文件，根据错误发现率<0.01的标准对数据进行筛选。以两组血清蛋白差异倍数>1.20为蛋白表达上调，<0.83为蛋白表达下调。

1.4 生物信息学分析 通过Uniprot数据库中的注释信息鉴定筛选出差异表达蛋白质，选择GO的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类和富集分析；利用KEGG数据库进行信号通路分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。用双样本等方差假设对两组蛋白相对表达量进行双尾t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异蛋白筛查结果 与对照组比较，SONFH组共鉴定出差异表达血清蛋白16种。其中免疫球蛋白重链1(IGHV1OR15-1)、铜蓝蛋白(CP)、α1-酸性糖蛋白(ORM1)、补体C9(C9)、IGHG1蛋白、C反应蛋白(CRP)、结合珠蛋白(HP)表达上调。SERPINA4蛋白、凝溶胶蛋白(GSN)、凝血因子Ⅻ(F12)、色素上皮细胞衍生因子(SERPINF1)、备解素(CFP)、巯基氧化酶1(QSOX1)、凝血因子ⅩⅢ(F13A1)、KRTDAP蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)表达下调。

2.2 差异表达蛋白GO功能注释聚类分析结果 生物过程方面发现差异蛋白主要参与了单一生物过程、细胞过程、生物调节、应激反应、生物过程的调控、代谢过程、生物过程的负调控、多细胞生物过程、生物过程的正调控、细胞定位、多生物过程、发育过程、免疫系统过程、信号传导、生长过程、细胞成分组织、细胞定位、节律过程、生物黏附。分子功能方面发现差异蛋白主要涉及结合、催化活性、分子功能的调节、抗氧化活性。细胞构成方面差异蛋白主要定位于胞外区、细胞器、细胞膜、大分子复合物组分、膜蛋白、细胞外基质、细胞连接等部位。

2.3 差异蛋白KEGG通路注释聚类分析结果 见表1。

表1 差异蛋白参与的信号通路

3 讨论

迄今为止，SONFH的发病机制尚不明确。国内外研究者从分子、基因水平对SONFH发病机制进行深入研究，提出了多种学说，如脂质代谢紊乱、血液凝溶、氧化应激反应、微血管损伤、细胞凋亡学说等[5]；但只针对某一病因，大多涉及1个或多个细胞因子、酶、基因等，而疾病的发生发展可能是多种因素的结果，目前尚无一种学说能够全面阐明其发病机制。本研究应用TMT联合2D-LC-MS/MS技术检测，筛选出SONFH组与对照组有差异的蛋白16个，通过KEGG通路注释进一步提取到与8个差异蛋白相关的12条KEGG信号/代谢通路。差异蛋白主要集中在补体与凝血级联反应、系统性红斑狼疮、肌动蛋白细胞骨架调节、p53信号通路、卟啉和叶绿素代谢、FcγR-介导吞噬等，说明血液凝溶系统、免疫系统、脂代谢及基因多态性与SONFH的发病密切相关。

血液高凝状态被认为是SONFH的关键性发病因素，F12、F13A1在机体血液凝溶系统中发挥重要作用。F12是血管生成的生理性调节因子，抑制凝固过程的发展，激活凝血酶活化纤溶抑制物，抑制纤维蛋白溶解，可在血管损伤的修复中发挥重要作用。Raghu等[6]指出F13A1表达异常，引发机体高凝状态，增加了SONFH的发病风险。本研究发现，SONFH组与对照组比较，F12、F13A1表达下调，并富集至补体和凝血级联反应信号通路。CP作为血清中一种具有氧化酶活性的α2-糖蛋白，可促进细胞生长、诱导血管生成或新血管形成的生理作用。王伟等[7]研究表明，在类风湿患者中，CP表达的高低与类风湿因子呈正相关，可见CP与类风湿密切相关；但其在SONFH发病机制所起的作用尚未见报道。本研究结果显示，SONFH组与对照组相比，CP蛋白表达上调，并富集至卟啉和叶绿素代谢信号通路。提示SONFH患者股骨头的坏死塌陷及随后出现的修复反应，血管的生成可能处于一种活跃状态。股骨头坏死与修复不是完全分开而是同时交织进行，因此推测F12、F13A1、CP可能在股骨头坏死与修复过程中发挥诱导新血管形成的作用。本研究认为F12、F13A1、CP可能是SONFH的特异性蛋白标志物。

免疫系统蛋白表达与SONFH发病机制紧密相关，补体系统在组织重塑过程中起着调节细胞凋亡和坏死的重要作用。C9具有防止免疫复合物沉着、活化补体的作用。Cuadrado等[8]认为，在SLE等自身免疫性疾病中经常发现的抗磷脂抗体能引起血栓，使患者处于骨坏死高危状态，激素的应用则增加了自身免疫性疾病骨坏死的发病率。本研究也观察到免疫反应相关蛋白在SONFH血清中的表达上调，并富集至补体和凝血级联反应、系统性红斑狼疮、朊病毒疾病、阿米巴病四条信号通路，提示免疫反应可能涉及该病的发病过程，这些蛋白有可能涉及补体的激活。HP作为一种血浆糖蛋白，具有能与红细胞外血红蛋白结合构成非共价复合物的生理功能，当机体介导炎症时其血浆中的含量升高[9]。本研究发现，SONFH组与对照组比较，C9、HP表达上调，提示SONFH患者可能因为免疫系统紊乱，加重了坏死组织损伤并阻滞骨组织的修复。基于此，推测C9、HP可能是SONFH的特异性蛋白标志物。GSN是一种肌动蛋白，介导细胞因子的释放、炎性细胞的凋亡以及炎性介质的清除等，对炎症反应发展与转归有极其重要影响。Hu等[10]对类风湿关节炎与SLE患者的GSN进行测定，结果提示GSN可能对SLE的诊断和活动度判断有重要价值。Wu等[11]通过血清蛋白质组学技术发现，ONFH患者中GSN水平较对照组下降，提出GSN参与了体内的各种有害反应，但GSN在ONFH中的生物学作用尚不清楚。本研究发现，SONFH组与对照组比较，GSN下调，并富集至肌动蛋白细胞骨架调节、FcγR-介导吞噬、病毒致癌这3条信号通路上，反映其在SONFH中发生的各种有害反应，包括细胞凋亡、组织坏死或骨坏死以及血管退化。推测GSN极其可能是SONFH的特异性蛋白标志物。

脂质代谢紊乱是SONFH的主要病理表现。脂肪因子在脂质代谢过程中起着重要作用，PEDF是脂肪来源的分泌性糖蛋白，通过甘油三酯脂肪酶来调节脂质代谢[12]。孙少松等[13]发现，PEDF可明显提高成骨细胞的迁移能力，抑制成脂主要调节因子PPARγ-2的表达，上调成骨标志因子Runx2的表达，有效促进成骨细胞向成骨分化及矿化，从而改善成骨细胞的功能。本研究中，SONFH组与对照组相比，PEDF表达下调，显示SONFH患者存在骨代谢水平的改变，其成骨细胞数量明显减少。因此本研究认为PEDF可能是SONFH的特异性蛋白标志物，提示SONFH患者存在脂质代谢异常及氧化应激水平的改变。SONFH患者长时间服用GC，可能导致机体血管脂肪栓塞、血脂升高、骨细胞脂质代谢功能障碍，从而进一步降低了股骨头骨髓基质干细胞增殖及分化能力，甚至直接诱导骨髓干细胞分化为脂肪细胞而发生骨坏死，进而诱发ONFH。

基因遗传多态性与SONFH发病机制密切相关。IGFBPs家族具有调节骨代谢及其相关疾病的作用不断得到实验研究与临床观察的证实，但其基因多态性与SONFH的关系一直未见报道。研究表明，IGFBP3与股骨头坏死的发生发展密切相关。Hong等[14]在2010年应用基因芯片分型技术发现，IGFBP3基因rs2453839突变位点与ANFH发生发展呈现高风险，首次阐述IGFBP3基因多态性与ONFH发病关联。季志英等[15]发现，早熟患儿血清IGF-1水平升高而IGFBP3水平降低，表明早熟患者成骨细胞的刺激因子、血清中软骨细胞分裂增殖水平升高。本研究发现SONFH组IGFBP3表达下调，并富集至p53信号通路、在癌症转录失调，可能证实IGFBP3基因多态性与SONFH存在高度相关性，为进一步进行该基因相关的表观遗传学研究奠定了基础，也为临床SONFH的分子水平防治，提出了监控的主要分子靶标之一。

综上所述，本研究应用差异蛋白质组学的研究方法，应用TMT联合2D-LC-MS/MS技术及蛋白质组学检测技术，筛查出F12、F13A1、CP、HP、补体C9、GSN、PEDF、IGFBP3等与SONFH相关的差异表达蛋白质，极可能是SONFH潜在的特异性生物学标志物。以上蛋白涉及与SONFH发病机制密切相关的血液凝溶系统、免疫系统、脂类代谢及基因多态性，但其在SONFH发生、发展中的具体作用机制尚未完全清楚，需进一步研究评价其可靠性。

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