以甘油为碳源生产细菌纤维素条件优化

马春华，辜文彦，王依静

（武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300）

细菌纤维素（bacterial cellulose，简称BC）是由各种类型的细菌合成的，在材料、造纸、医药及食品领域都有广泛的应用[1-3]。与天然纤维素相比，细菌纤维素具有高持水性、高机械强度、良好生物相容性等独特性能[4],但其发酵工艺落后、产量低、生产成本高一直是限制其应用于高附加值产品生产的瓶颈[5]。在细菌纤维素的研究上，多集中在原料的利用、菌种的选育上[6]及发酵条件的优化[7]等。马霞等[8]以酒糟浸出液发酵产细菌纤维素，研究出最优的培养基配；Cheng等[9]以水解玉米杆为碳源，绿色合成细菌纤维素；还有研究用豆渣制备BC[10]。

能够产生纤维素的微生物主要有9个属，但真正能够大批量生产细菌纤维素的只有醋酸菌属中的几个种，特别是醋酸菌属中的木醋杆菌，已成为生产BC的模式菌株[11]。

近年来，由于能源紧缺及各国从环境保护和资源战略的角度出发，生质柴油发展迅速，甘油作为在生质柴油的炼制过程中含量最高的副产物（约为甘油量的10%），因生产过剩而价格下跌，开发甘油的新工业用途，意义重大。

有鉴于此，本研究利用木醋杆菌，以甘油为主要原料合成细菌纤维素，将可提升生质柴油制程中的附产品甘油的利用率，将其转化成高附加值的产品——细菌纤维素。并开发A4尺寸大小的细菌纤维素，可以作为面膜裁剪原料，为细菌纤维素的开发利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：木醋杆菌（Acetobacter xylinum）购自上海谷研生物；甘油，工业级，维之城化工有限公司。

1.2 试验仪器

立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-75SII）上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温培养箱（DRP-9162）上海培因实验仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet is5），Thermo Fisher。

1.3 培养基配方

斜面菌种培养基：葡萄糖 5%，蛋白胨0.5%，酵母膏 0.5%，柠檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%，琼脂 2%。

种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%， 柠檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%。

液态培养基：甘油（或葡萄糖）2%、酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，柠檬酸0.5%，Na2HPO4·12H2O 0.5%。

所有培养基121℃灭菌20 min。

1.4 三步发酵培养方法

1.4.1 一级种子震荡培养

取1环活化好的斜面种子接入150 mL种子培养基，充分振荡，30℃振荡培养24 h。

1.4.2 二级种子扩大培养

取振荡培养后的种子培养基，以10%接种量接入相同体积的新种子培养基，30℃振荡培养20 h。

1.4.3 静态发酵培养

取二级种子10%接种量接入盛有发酵培养基的培养容器中，30℃静置培养7 d。

1.5 细菌纤维素的制备

按照上述发酵培养基的浓度配制液态培养基置于250 ml三角锥形瓶中，用矽胶塞将瓶口塞紧，灭菌。待降温降压后，无菌操作，接种种子液，充分摇动，使菌落分散均匀，于30℃培养箱中静置培养，细菌纤维素膜形成后取出。A4尺寸细菌纤维素，选用不锈钢、玻璃、塑料为材料的容器。

1.6 细菌纤维素的处理

从培养容器中取出细菌纤维素膜，用蒸馏水多次冲洗除去膜表面杂质，直至细菌纤维素膜呈白色半透明状，再用去离子水反复冲洗至中性，经冷冻干燥36 h后称重。纤维素产量表示为g（纤维素/干重）/L（培养液）。

1.7 细菌纤维素鉴定

利用傅里叶红外光谱分析所得产物。

2 结果与讨论

2.1 接种量对BC合成的影响

按2%、4%、6%、8%、10% 的接种量，30℃培养 7 d。如图1所示：不论是以葡萄糖或甘油为碳源，当接种量在2%～6%时，随着接种量的不断增加，BC的合成逐渐增多，当接种量为6%时，BC的产量最高。接种量超6%以后，细菌纤维素的产量下降，相同条件下，甘油比葡萄糖合成更多的BC。这是因为木醋杆菌为严格好氧菌，在接种量较高的情况下，木醋杆菌数量多，对氧气的需要量就大，但发酵液的溶氧条件有限，导致细菌因供氧不足影响到BC的合成[12]。接种量也影响培养周期，种子溶液浓度高时，培养周期可以缩短，尤其是延迟期；当接种量太高的时候，往往会导致培养基中的底物在早期消耗过快，不利于后期细菌生长代谢产物的累积[13]。

图1 接种量对发酵的影响Figure 1 Effect of inoculation amount on fermentation

2.2 甘油浓度对BC合成的影响

甘油浓度为1%、1.5%、2%、2.5%和3%，接种量为6%，30℃培养7 d，甘油浓度对BC合成的影响如图2所示：当甘油浓度在2%时，BC的合成量为5.2 g·L-1，继续增加甘油浓度时，产量略有下降，合成BC最适生产的甘油浓度为2%。

图2 甘油的浓度对细菌纤维素产量的影响Figure 2 Effects of concentration of glycerol on the yield of bacterial cellulose

2.3 培养时间对BC合成的的影响

在培养温度为30℃，甘油浓度为2%，接种量为6% 的条件下，考察 4、5、6、7、8 d，对细菌纤维素合成量的影响。结果如图3所示，最佳发酵时间为7 d,吕鸿皓[14]等木醋杆菌利用大豆糖蜜为原料生产BC，最佳发酵时间为6 d。

图3 发酵时间对细菌纤维素产量的影响Figure 3 Effects of fermentation time on cellulose production

2.4 A4生物细菌纤维素膜的制备

2.4.1 培养模具的选择

选用不同材料的模具，进行A4大小BC膜的制备，结果如表1所示，以不锈钢材料的最好，BC膜表面光滑平整，呈乳白色，如图4，这个尺寸的BC膜可用作面膜材料。

表1 不同材质培养器具对细菌纤维素外观形态的影响Table 1 Effects of container material on the appearance of bacterial cellulose

图4 A4大小细菌纤维素Figure 4 A4 size of bacterial cellulose

2.5 红外光谱分析

从图5可以看到在3 346 cm-1处有一个强且宽的-OH振动伸缩峰，2 901 cm-1处是-CH的伸缩振动峰，1 643 cm-1处是4半缩醛基团的吸收峰，1 315 cm-1代表C-H的伸缩振动，1 059 cm-1代表C-O-C的伸缩振动[14-15]，这些基团与纤维素的分子结构式中所包含的有机化合物基团基本吻合。

图5 细菌纤维素红外光谱图Figure 5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

3 结论

本试验的结果表明：工业甘油适合做木醋杆菌发酵的基本培养基制备细菌纤维素，其发酵最佳条件为：甘油量2%、接种量 6%、30℃ 静态培养7 d，细菌纤维素的产量高达5.4 g·L-1。A4尺寸大小的细菌纤维素薄膜制备以不锈钢盆作为模具效果最好。