2017国际工作犬训练使用与育种技术培训班动物克隆技术外专讲学综述

万九生 金永勋

2017年12月15日，根据国家外专局引智计划，受公安部五局委托，由中国工作犬管理协会主办的“2017国际工作犬训练使用与育种技术培训班”在上海成功举行。公安部五局程克千处长到会并做讲话，来自全国公安各有关单位、军队、武警、铁路、消防、海关、保安和民间等工作犬系统和社会团体的230余名从事工作犬训练、使用、繁育的技术人员和管理人员参加了此次培训。

本次会议特别邀请到了在生物技术领域里的世界级科学家、世界克隆犬之父-黄禹锡教授。黄禹锡教授是一个在生物技术领域里的世界级科学家，2005年世界首次克隆了第一头克隆犬“Snuppy”，也创建了世界上唯一提供商业犬类克隆的机构秀岩生命工程研究院。第一头克隆犬面世之后很多国家邀请黄教授给他们克隆特殊工作犬，至今他的团队已经克隆出了800多头克隆犬。黄禹锡专家就其自身的发展历程、利用克隆犬等尖端科学技术迅速培育及改良工作犬的技术、动物克隆技术研究进展等专题，通过理论剖析与现场视频教学，做了深入细致的讲学，其主要内容及观点体会综述如下。

一、克隆犬之父-黄禹锡的发展历程及成果

被誉为“克隆犬之父”的黄禹锡（Hwang Woo-suk）教授重点介绍了2005年从首尔大学出来，2006年7月牵头创办秀岩生物工程研究院。该院是动物克隆、胚胎干细胞与转基因等先进生物技术应用与生物工程和生物医学领域为主题的一个非营利机构，也是黄禹锡教授为中心的科研机构。作为秀岩研究院首席技术官，黄教授带领他的科研团队已创造出了多项世界第一：1999年在世界上首次培育成体细胞克隆牛；2002年培育出了克隆猪；2003年又首次在世界上培育出“抗疯牛病牛”；2004年建立世界首例体细胞核移植人类胚胎干细胞(NT-1)并且申请专利；2005年成功培育出世界首条克隆犬“Snuppy”； 2009年克隆“911英雄犬”并且转让给美国政府；2010年世界首例体细胞核移植人类胚胎干细胞(NT-1)获得欧盟专利；2011年全球首次成功诞生犬科动物的异种间动物克隆(郊狼诞生)。

近年来，黄教授的科研团队，主要进行研究开发当今科学界最有潜力的患者特异性胚胎干细胞，为人类器官移植无菌小型猪，克隆特殊工作犬和宠物犬及克隆濒临灭绝动物或以灭绝动物的复原等世界瞩目科研领域里的研究。最近从世界各国获得了世界第一号人类克隆胚胎干细胞（NT-1）的国际专利。在《Nature》等国际高水平杂志上发表多篇学术论文，SCI论文78篇，并被多次引用，获得10余项世界领先成果和专利。

二、动物克隆研究进展

黄教授的研究团队在转基因和克隆技术包括犬、猪、牛等方面在全世界顶级，特别是克隆顶尖的护卫犬，缉毒犬、搜爆犬、导盲犬和赛犬等工作犬，克隆人类疾病模型动物和转基因动物生产以及濒临灭绝动物的研究方面取得了很好的成功。

（一）克隆犬研究

在犬的克隆方面，黄教授带领的秀岩科研团队，自2005年克隆犬成功以来，通过多年的不断探索研究，从千万次失败的试验中积累、总结出其独特的经验和方法，从而成功建立起一套准确预测母犬排卵时间和活体取卵的操作技术，能有效获得成熟的卵母细胞用于犬的克隆生产，解决了制约克隆犬生产的最大难题，具备非常强大的科研力量和先进成熟的克隆技术，为韩国国家警察机构批量克隆114头工作犬（搜毒犬、搜爆犬、搜救犬等），以及为美国、加拿大等34个国家地区克隆出数百头优秀工作犬，并且将克隆犬广泛应用于实战中，表现出了卓越性能。还进行了宠物犬克隆的商业化推广，获得了良好的效果。

（1）活体取卵

诱导麻醉和呼吸麻醉相结合麻醉卵母细胞供体母犬后，利用高频电手术刀沿腹中线开小口，手指插入拉出一侧卵巢，找出输卵管，通过“冲洗（flushing）”的方式从母犬体内收集卵母细胞。具体的操作方法为：将“冲卵-接卵”装置（专利保护）的球形一端由输卵管在卵巢囊上的开口沿输卵管走向插入输卵管中，并用针线对球形端口在输卵管上位置进行结扎固定，接着利用留置针将导管引入输卵管与子宫的连接处，并通过注射器从导管口缓缓注入冲卵液，同时将经输卵管从“冲卵-接卵”装置的方形一端流出的冲卵液用小培养皿进行收集。一侧输卵管冲卵完成后，运用同样的操作方法对另一侧输卵管进行冲洗，冲洗液收集于同一个小培养皿中。冲卵结束后进行缝合。

（2）卵母细胞的染色及显微操作去核

在显微镜下对冲卵液中的卵母细胞进行挑取，一般情况下，1头发情母犬经冲卵后大约能获得6～12枚成熟卵母细胞。随后利用粗细不同的挑卵针对卵丘-卵母细胞不断吹打以除去卵母细胞周围的多层卵丘细胞，吹打完成后，将卵母细胞转移至显微操作间进行荧光染色，使胞内遗传物质细胞核染上绿色荧光后，利用显微操作系统对卵母细胞进行去核操作。

（3）供体细胞核移植到去核卵母细胞中

通过显微操作系统，吸取待克隆犬的核供体细胞，依次注入到已去核卵母细胞中，一个去核卵母细胞加一个核供体细胞便组成了一个“核质”完整的重构胚胎。紧接着对重构胚胎进行融合和激活，使其具有继续发育的能力。

（4）代孕母犬及克隆仔犬的护理与保健

秀岩建有专门的室内代孕母犬及克隆犬只饲养与护理室，室内设若干个单间犬舍，布局科学合理，环境温馨整洁，并安装有空调与犬舍必备的淋浴冲洗等设备。克隆胚胎代孕母犬及初生克隆犬只均在护理室内进行饲养管理，专人精心管理，克隆犬只表现出良好的生长发育和行为表现，通过考察可以看出其管理水平很高。

另外，通过培训和交流，我们还获知了一些与克隆犬相关的重要技术和研究方法：①在活体取卵和胚胎移植这2个环节之前，秀岩已通过特定仪器每天对若干发情母犬孕酮水平进行测定，从而选择出2头排卵时间相近的母犬分别作为卵母细胞供体母犬和胚胎移植代孕母犬；②秀岩所使用的供体细胞大多来源于成体犬腹股沟（大腿根部）约1cm2的皮肤组织，这一位置的采样能避免对犬的美观性造成伤害；③克隆犬研究中所使用的母犬主要来源于韩国肉用犬农场，韩国有一些大型的肉用犬养殖场可以提供大量的试验用犬，其所用母犬全部为自然发情的犬只；④准确测定母犬的排卵时间依赖于特定的仪器和经验的总结，这对于其他研究者将需要花费大量的时间来摸索；⑤活体取卵的成功还有赖于对“冲卵-接卵”装置的突破；⑥胚胎移植中，含胚胎培养液的注入量、注入位置、注入速度都有经验的凝结来保证成功率。

（二）克隆濒危灭绝动物(同种或异种间克隆)研究进展

在 2011年，黄禹锡教授的研究团队，全球首次在利用杂种犬为代孕母克隆了七头稀有的亚洲郊狼的异种间动物克隆中取得了成功。异种间动物克隆的成功对今后灭绝动物的复原提供了新的可能性，也在黄禹锡研究团队进行猛犸象复原课题中起到了启发性作用。全球首次异种间郊狼的克隆曾在2012年俄罗斯NTV中被选为世界10大新闻。得到这消息后俄罗斯的东北联邦大学希望与黄教授建立伙伴关系，一起进行一个叫“重现猛犸象”的项目。大家都认为这是一个令人无法抗拒的想法，而且并不像看起来那么令人惊讶，但在科学角度来看理论上是可行的。日本的科学家已经用一个冻存了16年的细胞，成功克隆出了一只老鼠，证明长期冻存并不是不可逾越的障碍。关键的是老鼠的细胞是在稳定的状态下冻存的。但在猛犸象的个案中，猛犸象的组织却经历了多次的冷冻和融化，想找出有活性猛犸象细胞比海底捞针还难。如果获得了合适的样本，我们可以借用跟猛犸象的体积大小最接近的亚洲大象的卵子和代孕母复原灭绝几万年的猛犸象。

三、体会与值得借鉴之处

通过培训和交流，体会了韩国克隆犬技术的成熟应用，实验操作的规范与严谨，克隆犬在韩国警方的普遍应用，开阔了视野，学到了新技术、新理念、新方法。

（一）个人的优势与岗位的恰当配置能促使团队力量更加强大。秀岩生命工学研究院仪器设备先进、管理规范、运行井然有序，其研究人员分工明确、各司其职，根据其自身的专业特长专门为克隆研究中的某一环节工作，保证克隆每一环节的工作都达到最佳效果，从而保障克隆的成功率。不得不说，在黄教授的团队中，个人的技术优势与工作岗位的结合做得非常好，体现在克隆操作中的一些关键环节均由相应技术突出的人员来完成，这些人员能将这一环节操作技术发挥到最佳，这样环环相扣，整个研究团队的克隆实力必然也异常出色。

（二）研究结果固然重要，但科学的探索过程更加可贵。黄教授播放演示的克隆犬关键技术环节的视频，试验操作时间均为5～10分钟，而且对于剖腹手术做到滴血未出，这些细节都是保证手术成功的重要因素，更加确保了克隆的成功率。我们在惊叹、佩服的同时，更加深刻地认识到从不断探索到不断积累这一过程的重要性。黄教授也毫不避讳地提到，秀岩研究团队今日之所以能在克隆犬领域取得首屈一指的地位与成就，是经过十几年、成千上万次不断的尝试与失败，才从中摸索积累到可贵的经验，创立了当今世界领先的克隆犬技术体系。

（三）科研大环境的营造尤为重要。科研大环境不仅仅是靠几个实验或几篇论文来营造，而更多是一个体系。在秀岩生命工学研究院，以黄教授为首席科学家的科研团队人员齐整，各有所长；研究院的硬件设施先进齐备；科研氛围浓厚，人员大多来自韩国顶级的大学或科研机构，围绕克隆、干细胞和转基因技术做了大量的工作，延续性非常强，可以花费数年甚至数十年的时间和精力全部投入到一个研究项目中，这对于国内科研投入普遍重视短期效益提供了借鉴，也对我们今后的科研如何科学持续发展提供了借鉴。

（四）强化学术交流与合作，拓展科研思路和科学素养。学术交流是针对规定的课题，由相关专业的研究者、学习者参加，为了交流知识、经验、成果，共同分析讨论解决问题的办法，而进行的探讨、论证、研究活动。在培训和交流过程中，发现黄教授团队非常重视学术交流和科研合作，参加国际会议或国际间合作交流非常多，其中与我国的中科院和北大博雅等就开展了多项合作，并取得了很好的成效。

四、几点建议

（一）借鉴国外先进经验，提高警犬技术科技含量，增强工作发展后劲。借鉴和吸收韩国先进的克隆犬技术，抓好昆明犬克隆技术研究平台等重点实验室建设，组织和培养科研力量，力争攻克克隆犬成熟卵母细胞的活体收集、克隆胚胎移植等技术难关，逐步建立工作犬克隆技术体系，推广应用于工作犬繁育生产中，为一线工作犬实战部门装备量多质优的警用犬提供技术支持。

（二）建立全国功勋警犬体细胞库，充分保存和利用顶尖级警犬资源。通过细胞冷冻保存技术，采集全国被评为功勋级警犬的体细胞，进行冷冻长期保存，建立全国功勋警犬体细胞库，利用克隆犬技术批量克隆功勋警用犬，可达到保种和快速提高优良警犬的目的，提升警犬技术的科技含量和服务公安工作的能力。

（三）坚持“走出去，请进来”，与韩国秀岩生命工学研究院建立长效交流和合作机制。此次培训和交流使我们感受到了韩国克隆犬技术的先进性，推动警犬技术工作的重大作用和商业化推广应用的价值，开阔了视野，增进了交流，并且中国工作犬管理协会与韩国秀岩生命工学研究院黄教授达成了有关合作意向。因此，建议多组织和参与国内外学术合作和交流，拓宽我们犬业科技人员的科学思路，提高科学素养，为我国工作犬事业的不断发展增添新的动力。