麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑制初步研究

陈静，冷鹃，杨喜爱，廖丽萍，肖爱平，刘亮亮

（中国农业科学院麻类研究所，长沙410205）

金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌［1－3］，广泛分布于自然界。金黄色葡萄球菌是引起临床感染的常见致病菌，既可引起局部化脓性感染，如：甲沟炎、痈、伤口等，也可引起全身性感染，如：坏死性肺炎、心内膜炎、败血症等。同时，其也是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。受金黄色葡萄球菌污染后的食品，会发生腐败变质，且部分菌株会产生金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）而引起食物中毒，由金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病是引起人类死亡的第二大主要原因，且金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的首位。金黄色葡萄球菌生存能力较强，广泛分布在自然界中，如：空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中，严重危害着人类健康。随着抗生素广泛应用于临床，金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，并且呈现多重耐药性，这给临床治疗带来了困难。目前，从天然产物活性成分中寻找对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的化合物，是解决临床治疗金黄色葡萄球菌相关疾病的关键问题。

麻类作物药用价值研究始于华夏民族［4］，至今已有几千年的历史。随着各种提取、分离、检测技术基本成熟，麻类作物中活性成分分析更加明确。如：大麻作为一类重要的麻类作物，具有镇痛、通经活血、缓解疲劳等作用，且可治疗风湿病、痛风、破伤风等疾病。大麻植物中约有400种化合物，酚类化合物是大麻植物中已发现的一类主要活性成分，其中最主要的是四氢大麻酚、大麻二酚和大麻酚［5－7］；黄麻是一年生草本韧皮纤维植物，黄麻叶含有花青素，圆果黄麻叶含有固醇，具有强心作用，长果种黄麻叶可用于治疗气喘和痰症［8］。麻类作物活性成分丰富，具有潜在的药用价值，然而目前其在活性成分开发利用方面研究较少，需进一步加强麻类作物活性成分药理作用研究，提高麻类作物的利用率。目前，已发现黄檗、黄连等中草药对耐药金黄色葡萄球菌有抑菌作用。经查阅文献，尚未发现麻类作物关于金黄色葡萄球菌抑菌作用方面的研究。本试验拟以大麻叶、黄麻叶、红麻叶、苎麻叶提取物为研究对象，采用纸片法和对倍稀释法，测试金黄色葡萄球菌对大麻叶、黄麻叶等提取物的敏感性，并测定其抑菌圈大小和最小抑菌浓度（MIC），旨在筛选分离出新的治疗金黄色葡萄球菌菌株的母体化合物，并进一步探讨麻类作物中活性成分的药理作用，拓展麻类作物的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中黄麻1号（黄麻）、中杂红368（红麻）、中饲苎1号（苎麻）、中大麻2号（大麻）、金黄色葡萄球菌冻干粉ATCC25923。

蛋白胨、牛肉浸膏、NaCl、琼脂、0.1 mol/L无水磷酸氢二钠、75%乙醇、生理盐水、无菌水。

LDZX－50KBS型立式压力蒸汽灭菌器、SWCJ－1F型超净工作台、HZQ－X100A型恒温振荡培养箱、BSP－250型生化培养箱、分析天平、游标卡尺。

1.2 试验设计

1.2.1 样品的制备

取麻叶粉碎样30.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入95%乙醇溶液200 mL，将圆底烧瓶置于（90＋2）℃的恒温水浴锅中回馏提取2 h，重复提取2次，趁热过滤，合并滤液，冷却至室温。分别对大麻叶、黄麻叶、红麻叶、苎麻叶提取物进行旋转蒸发浓缩至干样，取95%乙醇分别将其复溶，浸膏质量浓度1.0 g/mL。

1.2.2 培养基的制备

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15～20 g，用蒸馏水定容至1000 mL，PH调至7.0～7.2，分装三角瓶，121℃高压灭菌30 min，待用。

1.2.3 菌种的活化

无菌条件下，将菌株冻干粉接种到复溶液滴瓶中，30℃恒温培养24 h。将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中，适宜温度下培养，用以菌种的保藏、传代及制备工作菌株。

1.2.4 菌悬液的制备

将活化好的菌种挑取1～3个菌落于盛有10 mL无菌生理盐水的试管中，摇匀，制成菌悬液。取1 mL菌悬液进行等梯度（10－1）稀释，共取8个浓度梯度，采用平板菌落计数法确定菌悬液浓度约为1.5×107个/毫升。置4℃保存备用。

1.2.5 滤纸片法检测大麻提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

无菌条件下，吸取金黄色葡萄球菌菌悬液200 uL，加入到营养琼脂培养基的培养皿表面，用无菌三角玻璃涂布棒涂抹均匀，将灭菌后的0.5 cm的滤纸片浸于麻叶提取液（1.0 g/mL）中，将其风干并平贴在含菌培养基表面，在每个含菌平板上等距离放置4片，其中，一片浸无菌水滤纸片做空白对照，放入培养箱35～37℃培养24 h，观察菌落生长情况，采用十字交叉法，用游标卡尺测量抑菌圈两个垂直方向的直径，每个试验重复3次，取其平均值作为测定结果［9，10］。

1.2.6 麻叶提取物最小抑菌浓度的测定

采用对倍稀释法获得浓度分别为 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.016、0.008、0.000 g/mL的麻叶提取物。各管加入100μL新鲜菌液，于35℃培养12 h，取200μL培养物接种于固体培养基观察菌落生长情况，每个试验重复3次，无金黄色葡萄球菌生长的最低麻叶提取物浓度为麻叶提取物最低抑菌浓度［11，12］。同时，取100μL培养物梯度稀释至10－6，取各浓度梯度培养液200μL接种于固体培养基，35℃培养12 h，菌落计数，估算各浓度麻叶提取物培养中金黄色葡萄球菌的活菌数（个/毫升）。

2 结果与分析

2.1 麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用

滤纸片法测定麻叶提取物抑菌活性结果表明：大麻叶和红麻叶提取物金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为15.92、12.99 cm，其抑菌作用显著。未检出黄麻叶和苎麻叶提取物金黄色葡萄球菌抑菌圈直径，不敏感，对金黄色葡萄球菌生长基本无抑制作用。可推测大麻叶和红麻叶中存在可破坏金黄色葡萄球菌正常生殖代谢的活性成分，为寻找临床治疗金黄色葡萄球菌相关疾病药物先导化合物提供了新的依据，根据抑菌圈直径大小指标，大麻叶提取物抑菌效果优于红麻叶提取物，结果见表1及图1。

表1 麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径Tab.1 The diameter of inhibitory ringlikes of extracts of bast fiber crop leaves

图1 麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径Fig.1 The diameter of inhibitory ringlikes of extracts of bast fiber crop leaves

2.2 麻叶提取物最小抑菌浓度

对倍稀释法和平板培养测定大麻和红麻提取物最小抑菌浓度结果表明：大麻叶和红麻叶具有相同的最小抑菌浓度，MIC均为0.0625 g/mL，即大麻叶和红麻叶提取物在0.0625 g/mL浓度下可抑制所有试验菌株的生长；同一样品不同提取物浓度之间，平板金黄色葡萄球菌生长密度随样品浓度逐渐降低（0.03、0.016、0.008 g/mL）而增加，呈现一定的剂量依赖关系；相同质量浓度的不同样品提取物比较，红麻叶提取物处理菌生长较大麻叶提取物处理生长良好，菌落数密度较大；与空白处理相比，0.008 g/mL红麻叶提取物基本无抑菌作用，而0.008 g/mL大麻叶提取物仍有一定的抑菌效果，这说明大麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于红麻叶提取物。结果见表2、3及图 2、3。

表2 麻叶提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度Tab.2 Theminimal inhibitory concentration of extracts of hemp and kenaf leaves

表3 麻叶提取物液体培养中金黄色葡萄球菌的活菌数Tab.3 The number of living S.aureus cultivated in hemp and kenaf leaves extract

图2 大麻样品最小抑菌浓度Fig.2 Theminimal inhibitory concentration of extracts of hemp

图3 红麻样品最小抑菌浓度Fig.3 Theminimal inhibitory concentration of extracts of kenaf

3 讨论

麻叶提取物对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用的初步研究结果表明，大麻和红麻提取物在体外对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，可进一步筛选分离其抑菌有效成分，寻找临床治疗金黄色葡萄球菌相关疾病药物母体化合物，这为耐药金黄色葡萄球菌感染疾病的治疗提供了新的探索，同时对药物仿生化学具有重要的理论价值。目前，关于金黄色葡萄球菌抑菌化合物的筛选在抑菌机制方面研究较少，同时，需结合金黄色葡萄球菌抗生素耐药机制的研究，从而有效的开发治疗金黄色葡萄球菌临床疾病的药物。本文以麻叶为研究对象，开阔了麻类作物在天然活性成分筛选方面的开发利用，以期为我国麻类作物资源的开发研究提供参考。

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