高效液相色谱电容耦合非接触电导检测器的研制及在药物分析中的应用

张凯鹏 杨秀娟 张 琳 陈缵光*

1(中山大学药学院， 广州 510006) 2(南方医科大学珠江医院药学部，广州 510282) 3(广东省生物工程研究所，广州 510316)

1 引 言

检测器是色谱仪器最重要的组成部分之一。非接触电导检测器最初应用于毛细管电泳[1,2]，后来在微流控芯片分析中发展迅速[3]。它对荷电和极性物质有很好的响应，且成本低、稳定性好、易于与其它检测器联用，因此备受关注。

2006年，电容耦合非接触电导检测开始用于高效液相色谱，Kuban等[4]建立了氨基酸、非甾体抗炎药和β受体阻断剂等几类物质的测定方法。此后的研究报道包括肽[5]、大环聚羧酸酯衍生物[6]、脂肪酸[7]的分析等。Mark 等[8]比较了两种用于高效液相色谱电容耦合非接触电导的检测池。然而，这些研究都采用商业化检测器，通常需要制作检测池，通过特殊的接头才能实现与液相色谱的连接[9]，使用不便，且不利于后续维护。而聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)管直接穿过的电容耦合非接触电导检测单元便于与液相色谱连接，且易于更换，成本较低，应用前景广阔。Gillespie 等[10]曾使用PEEK管直接穿过非接触电导检测池，但未对影响仪器性能的参数(电极间距、电极长度、PEEK管内径等)[11,12]做详细探讨。目前，关于高效液相色谱电容耦合非接触电导检测器的研究报道较少。

鸦胆子油是一种中药抗癌辅助药，为细胞周期非特异性抗癌药[13～15]，其主要抗癌活性成分是油酸和亚油酸。油酸和亚油酸均具有长碳链结构，末端含羧基，在鸦胆子油中主要以脂肪酸甘油酯的形式存在，为弱紫外吸收物质。传统方法如高效液相色谱柱前衍生化法[16]、蒸发光散射法[17]等均有其各自缺点，如操作过程繁琐、影响因素多，不利于油酸和亚油酸的准确定量分析。

本研究采用自制的高效液相色谱电容耦合非接触电导检测器，实现了对鸦胆子油有效成分的分离检测，为此类中药制剂有效成分的质量控制提供了一种新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Waters plus 717高效液相色谱仪(美国Waters公司); C18BP色谱柱(200 mm×4.6 mm， 5 μm，大连依利特公司); C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm， 5 μm，天津三维公司); FA1004分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司); ZB-2020色谱工作站(四川知本分析科技有限公司); SB-5200 DTDN超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。聚醚醚酮连接管(外径均为1.57 mm，内径: 0.13、0.25、0.50、0.75和1.00 mm，常州优沃世塑料制品有限公司)。所有电子元器件均购自广州天河赛格数码电子城。

十二烷基磺酸钠(SDS)、 油酸以及亚油酸分析标准品(纯度>99.9%, 上海晶纯生化科技股份有限公司); 甲醇、乙腈(色谱纯, 美国BCR试剂有限公司); 鸦胆子油软胶囊(华润三九(南昌)药业有限公司); 醋酸钠(NaAc，分析纯，天津市百世化工有限公司); NaOH(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)。 实验用水为超纯水, 由Millipore纯水仪(美国Millipore公司)制备。流动相使用前超声30 min，所有样品均需经0.45 μm滤膜滤过后进样。

2.2 溶液制备

2.2.1对照品储备液的配制准确称取十二烷基磺酸钠对照品10 mg，以10%乙腈溶液溶解并定容至10 mL。准确称取油酸、亚油酸对照品各10 mg，加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，用90%甲醇溶解并定容至10 mL。所有对照品溶液均在4℃条件下保存，用时根据需要稀释至所需浓度。

2.2.2鸦胆子油溶液的皂化精确称取鸦胆子油20 mg， 置于5 mL玻璃小瓶中， 加入0.5 mol/L NaOH甲醇溶液1 mL， 盖上盖子， 置于鼓风干燥箱中60℃反应30 min后取出， 用90%甲醇溶解并定容至10 mL， 4℃保存备用。

2.3 液相色谱分离条件

C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm， 5 μm)，流动相： 甲醇-乙腈-1 mmol/L醋酸钠溶液(50∶30∶20,V/V); 柱温: 25℃; 流速: 1.0 mL/min; 进样量: 20 μL。

2.4 电容耦合非接触电导检测器的制作

图1 高效液相色谱-电容耦合非接触电导检测装置示意图(A)检测控制单元; (B) 电极盒内部构造; (C) 非接触电极; a. 信号放大调节器; b.激发频率调节器; c. 激发电压调节器; d. 基线调节器; e. 电源开关; f.色谱柱; g. PEEK 连接头; h.信号屏蔽线; j,p. PEEK连接管; k. 屏蔽电路; l. 激发电极; m. 接收电极;n.信号插头Fig.1 Schematic illustration of HPLC-C4D system(A) detector control unit; (B) inside view of contactless electrodes; (C) contactless electrodes box; a. amplifier adjuster; b. excitation frequency adjuster; c. excitation voltage adjuster; d. baseline adjuster; e. power switch; f. chromatographic column; g. PEEK junction fitting; h .shielding wire; j,p. changeable PEEK tubing; k. ground circuit; l. excitation electrode; m. pick-up electrode; n. sockets.

如图1所示，所研制的电容耦合非接触电导检测器由信号发生器、电极套管、接收放大器等组成。信号发生器和接收放大器等与本研究组曾研制的电容耦合非接触电导检测器相似[18]。信号发生器可提供频率范围10～150 kHz、电压振幅0～100 V(有效值)的正弦高频信号。两个检测电极(非接触电极)由内径2.0 mm(液相色谱连接管刚好能穿过)的两个铜管构成，同轴固定于电路板上，检测电极单元最后装入5.3 cm×3.2 cm×1.5 cm的金属盒中。金属盒接地。将液相色谱PEEK连接管(外径1.57 mm)穿过检测电极，一端用PEEK连接头与色谱柱出口连接，另一端与紫外检测器相连接或放空。此连接方式并不破坏液相色谱的整个系统，使用方便。信号接收放大器将信号放大整流，经模/数转换后由色谱工作站和计算机实现数据的记录与处理。

3 结果与讨论

3.1 仪器参数优化

3.1.1激发电压的影响激发电压是影响电容耦合非接触电导仪器性能的重要因素之一。将激发频率设定在60 kHz，其它参数均固定，研究激发电压在15～90 V时对检测的影响。图2A是十二烷基磺酸钠的色谱图，根据其峰高和信噪比值可确定最优的激发电压。从图2B可见，随着激发电压增大，峰高也增大。当激发电压低于60 V时，信噪比随电压的增大而增大。然而，当电压高于60 V时，基线的噪音也增大，导致信噪比下降。 因此，选择60 V为最优的激发电压。

3.1.2激发频率的影响在激发电压为60 V的条件下，在15～120 kHz 范围内考察十二烷基磺酸钠(500 μg/mL)在液相色谱系统分离条件下的响应及信噪比情况(图2C)。激发频率低于70 kHz时，信噪比随着频率的增大而增大; 当激发频率大于70 kHz时，虽然峰高增大明显，但是噪音增大更为明显，导致信噪比大大降低。因此选择70 kHz为仪器的最优激发频率。

图2 (A)十二烷基磺酸钠的色谱图: 1. 溶剂峰; 2. 十二烷基磺酸钠(500 μg/mL)； (B) 激发电压对峰高和信噪比的影响(固定频率60 kHz); (C)激发频率对峰高和信噪比的影响(固定电压 60 V)Fig.2 (A) Response of SDS with C4D: 1.solvent peak; 2. SDS (500 μg/mL); (B) Influence of the excitation voltage on peak height and S/N at a constant frequency of 60 kHz; (C) Influence of excitation frequency on peak height and S/N at a constant voltage of 60 V

3.1.3电极间距的影响电容耦合非接触电导检测器的两个电极之间的间距对仪器性能也有影响。固定激发电压60 V，激发频率70 kHz，考察了电极间距在0.5～3.5 mm范围内，对500 μg/mL十二烷基磺酸钠在液相色谱系统分离条件下的响应及信噪比情况(图3A)。当电极间距小于1.5 mm时，峰高随距离的增大并不明显，但是信噪比同时也在增大，电极太靠近时，噪音相对较大，信噪比在电极间距较小时较低，这说明合适的范围内，影响信号的因素主要是噪音; 然而，当间距大于1.5 mm时，峰高和信噪比都出现了较大程度的下降，说明电极间距较大时，峰高成为影响灵敏度的主要因素。后续实验将电极间距固定在1.5 mm。

3.1.4电极长度的影响设定激发电压60 V、激发频率70 kHz、电极间距1.5 mm，考察电极长度在4～18 mm时，十二烷基磺酸钠(500 μg/mL)经液相色谱分离后的响应及信噪比情况。从图3B可见，随着电极长度增加，峰高也增高，但是当电极长度大于10 mm时，随着电极长度增大，信噪比并未明显增大，反而略有降低; 另一方面，电极长度过长，对分离度也会产生影响。因此，选择10 mm作为最优的电极长度。

图3 (A) 电极间距对峰高和信噪比的影响; (B) 电极长度对峰高和信噪比的影响Fig.3 (A) Effect of distance between excitation electrode and receiving electrode on peak height and signal to noise ratio (S/N); (B) Effect of length of excitation electrode and receiving electrode on peak height and S/N

图4 不同内径的PEEK管对电容耦合非接触电导检测灵敏度的影响流动相- 乙腈-水(35∶65， V/V); 流速，1 mL/min。 峰1. 十二烷基磺酸钠(20 μg/mL); 管径：a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d. 0.75 mm; e. 1.00 mm.Fig.4 Effect of the different internal diameters tubing on C4D sensitivity using SDS at a concentration of 20 μg/mL: a. 0.13 mm; b. 0.25 mm; c. 0.50 mm; d.0.75 mm; e.1.00 mm. Mobile phase composition: acetonitrile-water (35∶65, V/V); flow rate, 1 mL/min. Peak definition: 1. SDS.

3.1.5不同内径的PEEK管的影响高效液相色谱仪连接管的材料多用聚醚醚酮，适合用于非接触电导检测。在行业内，连接管的外径相同，为1/16英寸(即1.57 mm)，内径则有不同规格。不同的内径对应于不同的管壁厚度，对应于不同的耦合电容量和不同的回路总阻抗，最终影响检测信号强弱。连接管的内径越大，管壁越薄，耦合电容量越大，回路的总阻抗越小，得到的检测信号越强[19]。连接管内径还涉及扩散效应的影响。连接管的内径大于色谱柱出口的内径时，流动相从小内径的管路流进大内径的管路，常会引起成分区带的扩散，导致峰变宽，灵敏度变差，还使得分离度下降[20]。

图5 鸦胆子油样品和油酸、亚油酸标准品混合物的电容耦合非接触电导色谱图(a) 200 μg/mL标准品混合物, (b) 400 μg/mL皂化后的鸦胆子油样品. 色谱峰: 1. 溶剂峰; 2.亚油酸; 3.油酸。Fig.5 HPLC-C4D detection of (a) standard mixture sample at a concentration of 200 μg/mL, (b) Brucea javanica oil (400 μg/mL) sample with saponification process. Peak assignment: 1. solvent peak: 2.linoleic acid, 3.oleic acid.

考察了5种不同内径的PEEK连接管对灵敏度的影响。如图4所示，当PEEK连接管内径为0.13 mm时，几乎观察不到十二烷基磺酸钠的峰，可能是小内径管壁太厚，回路总阻抗太大，导致灵敏度太低，几乎观察不到信号。当使用内径为0.75和1.00 mm时，扩散效应明显。0.50 mm内径的PEEK连接管具有最高的峰高和信噪比，可能是管壁厚度和回路总阻抗适中，而扩散效应影响较小。综上所述，0.50 mm内径的PEEK管具有最高的灵敏度。

3.2 方法学验证

3.2.1精密度取100 μg/mL的油酸和亚油酸的混合标准品连续进样6次，色谱峰见图5a，记录峰面积，并计算相对标准偏差值。结果表明，油酸和亚油酸峰面积的RSD分别为1.5%和1.1%，表明仪器的精密度良好。

3.2.2方法重复性称取相同质量的6份鸦胆子油溶液，用同样的方法皂化处理，最终稀释至200 μg/mL，分别进样，色谱峰见图5b。结果表明，油酸和亚油酸峰面积的RSD值分别为1.9%和1.8%， 表明本方法具有很好的重复性。

3.2.3线性范围和检出限准确移取适量标准品储备液，配成系列浓度的标准溶液，在最优实验条件下进样，记录每个浓度所对应的峰面积，将浓度对峰面积作标准曲线。检出限通过配制系列低浓度样品，计算信噪比(S/N=3)得到。如表1所示，油酸及亚油酸在5～1000 μg/mL线性关系良好，r>0.99，检出限分别为2.5和1.0 μg/mL。

3.2.4回收率将对照品溶液按高、中、低3种浓度(每个浓度配3个样)分别加入到已知浓度的样品溶液中，测定加标回收率。如表2所示，油酸和亚油酸的平均回收率分别在99.0%～100.8%和98.0%～101.3%范围内，表明本方法测定结果准确可靠。

3.2.5样品稳定性将皂化后的样品放置于室温条件下，分别在0、4、8、12、24和48 h进样。结果表明，油酸和亚油酸峰面积的RSD值分别为1.8%和2.4%。因此， 样品在48 h内稳定性良好。

表1 亚油酸与油酸的回归方程、相关系数、线性范围及检出限 (浓度点, 9;y, 峰面积;x, 样品浓度)

Table 1 Regression equation, correlation coefficient, linearity range and limit of detection (LOD) of linoleic acid and oleic acid (n=9;y, peak area;x, concentration)

组分Components回归方程Regressionequation相关系数Coefficientofcorrelation(r)线性范围Linearrange(μg/mL)检出限LOD(μg/mL)亚油酸Linoleicacidy=5174．1x-2．40×1040．99925～10001．0油酸Oleicacidy=9163．4x-0．70×1040．99845～10002．5

3.3 样品分析

选取3个批次的鸦胆子油软胶囊进行测定，结果列于表3。鸦胆子油中油酸含量在51.6%～55.8%之间，亚油酸含量在30.3%～32.8%之间，是鸦胆子油的两个主要成分。与其它方法比较，油酸含量较为接近，本方法测得亚油酸含量为30%，而高效液相色谱(HPLC)紫外直接测定法[21]测得亚油酸含量为12.5%，HPLC-紫外柱前衍生化法[22]测得亚油酸含量为23.4%, 这可能是由于不同厂家、不同产地的原材料提取的鸦胆子油的有效成分存在差异，这也体现了中药质量控制的复杂性。目前，药典中并未有鸦胆子油软胶囊中油酸、亚油酸的具体质量标准，而油酸和亚油酸作为鸦胆子油的两个主要成分，其含量的测定对药物质量的控制具有重要意义，本研究为鸦胆子油的质量控制提供了一种新方法。

表2 亚油酸与油酸的加标回收率实验结果

Table 2 Recoveries of standard additions of linoleic acid and oleic acid

组分Components测定值Found(μg/mL)加入量Added(μg/mL)测得量Totalfound(μg/mL，n=3)回收率Recovery(%，n=3)相对标准偏差RSD(%，n=9)亚油酸Linoleicacid131．5油酸Oleicacid243．8100．0231．298．0125．0258．1101．3150．0278．698．4200．0446．1100．8250．0494．899．1300．0537．699．02．81．7

表3 3批鸦胆子油软胶囊的测定结果与其它的方法的比较

Table 3 Comparison of detection results of contents of linoleic acid and oleic acid in samples ofBruceajavanicaoil (n=3) by this method and literature methods

批号Batchnumber本方法Thismethod∗(n=3)1503002J1506007J1506008J其它方法OthermethodsHPLC⁃紫外直接测定法[21]HPLC⁃UVHPLC⁃紫外柱前衍生化法[22]HPLC⁃derivatization亚油酸Linoleicacid(%)31．6±0．732．8±0．930．3±1．112．523．4油酸Oleicacid(%)55．8±1．255．8±0．151．6±0．961．365．6

上述结果表明， 此检测器具有优良的性能，适合于用于荷电或极性成分的定性和定量分析。但此检测器的灵敏度相对较低，可能由两方面的原因： (1)仪器方面，因为目前所能得到的液相色谱连接管的管壁均较厚，导致回路总阻抗较大。虽然提高激发频率可以降低回路阻抗，但噪音增加，信噪比改善不明显; (2)电导检测是基于被测成分与背景溶液的电导值的差异，而液相色谱测定荷电或极性成分时所用流动相的背景电导值是相当大的，这是灵敏度不高的主要原因之一。

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