基于SNP芯片揭示中国玉米育种种质的遗传多样性与群体遗传结构

赵久然，李春辉，宋伟，王元东，张如养，王继东，王凤格，田红丽，王蕊

（北京市农林科学院玉米研究中心/玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室，北京100097）

0 引言

【研究意义】玉米在长期的驯化过程中，表型和基因型水平上都形成了极为丰富的遗传多样性。这些多样性的种质资源中，很多已经被广泛应用到玉米育种实践，对中国玉米育种发展起到了重要的作用。种质资源的遗传多样性与群体结构分析，可以揭示资源的遗传特性，为育种家选材提供信息，并为后续的种质改良与品种选育提供参考。【前人研究进展】中国玉米自交系主要来源于国内地方种和外来种质[1]。在中国玉米品种改良过程中，发掘和利用地方种质是解决品种适应性问题的重要途径[2]，其中贡献最大的是以丹340为代表的旅大红骨种质和以黄早四为代表的黄改群（塘四平头）种质，这两个本地化杂种优势类群经过多年的改良和利用，形成了很多在育种实践中广泛应用的骨干自交系。20世纪50年代后期，美国单交种开始出现并被大面积应用，形成了 SS群体、NSS群体和Iodent群体3个主要的杂种优势类群，并且从20世纪70—80年代开始引入中国，先后引入少数优良自交系，如Oh43、C103、B73、Mo17等代表系，这些自交系经遗传改良形成了中国杂种优势类群中的兰卡斯特种质和瑞德种质[3]。随着国外商业化杂交种被大量研制，很多国外优秀杂交种的二环系选系逐渐成为新自交系的主要来源，20世纪70年代末，从引进的国外商业化杂交种中选育出了掖 8112、铁7922、沈5003、掖478、郑58等优良自交系，形成了中国的改良瑞德类群[4]。20世纪70—80年代，以先锋杂交种P78599选系为代表，选育出齐319、X178等材料，形成了 P群种质[5]。近年来，北京市农林科学院玉米研究中心利用外来新种质X1132X作为基础材料，通过在高密度、大群体、变换地、强胁迫等条件下进行严格选择，选育出京724、京725、京464、京MC01等一批优良骨干自交系[6]。在此基础上，以自交系京92和京2416等黄改系作为父本，探索创新了杂种优势模式，组配出京科968（京724×京92）、京科 665（京 725×京 92）、NK718（京 464×京 2416）和京农科728（京MC01×京2416）等系列玉米新品种[7]。由于玉米育种实践的不断推进、研究材料的差异、分子标记类型和数量的差异等因素的存在，研究者对中国玉米种质的遗传评价从未停止过。比较前人的研究结果发现，由于研究者利用 RAPD、RFLP、AFLP、SSR和SNP等不同的分子标记，对不同玉米种质进行遗传评价和聚类分析[7-13]，因此得出的结论稍有差异，但一般都会有黄改群、旅大红骨群、瑞德群、兰卡斯特群等几个种质群，有一些研究中划分出了P群、改良瑞德等类群。【本研究切入点】随着玉米育种实践的不断推进，大量优异玉米种质被不断培育和释放。由于新种质不断被应用，有必要更全面地收集目前品种选育中应用的种质，对已有杂优模式和创新杂优模式的各类群玉米自交系做更系统的分析。【拟解决的关键问题】本研究344份玉米自交系包含了当前或历史上玉米育种中应用的重要种质资源，并收纳了美国三大主要杂种优势群的代表系，具有广泛的代表性。利用覆盖全基因组的SNP位点，揭示上述重要玉米育种种质的群体结构和遗传多样性，并探讨玉米种质在改良过程中基因多样性的变化趋势，全面阐述中国玉米种质的遗传特征，为玉米育种实践提供指导和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料由344份玉米自交系组成（电子附表1），包括（1）美国主要杂种优势群瑞德群、兰卡斯特群、Iodent群；（2）由国内地方种质发展出的黄改群和旅大红骨群；（3）从美国商业化杂交种选系发展出的改良瑞德群和 P群；（4）近年来，在中国玉米育种中应用的新种质。供试自交系能够反映目前中国玉米生产中应用的种质资源的遗传多样性，具有较为广泛的代表性和时效性。

1.2 基因型鉴定

利用北京市农林科学院玉米研究中心研发的包含3 072个SNP位点的MaizeSNP3072芯片对供试自交系进行基因型分析。每个样品取50—60单株叶片形成一个混池，按照改进的CTAB法提取基因组DNA[14]。利用 iScan芯片扫描仪获取高分辨率的图片，所得数据直接导入GenomeStudio software v2011.1（Illumina and GoldenGate data）软件，利用北京市农林科学院玉米研究中心确定的基因分型文件自动分析，获得每个样本的基因型数据。从基因型数据中过滤掉分型较差的SNP位点和缺失率大于50%的位点，从而得到了2 869个高质量的SNP位点，这些位点的基因型数据将用来进一步分析。

1.3 数据分析

利用PowerMarker V3.25软件[15]计算多态信息含量（PIC）、平均等位变异和基因多样性等。利用PowerMarker 结合 MEGA 4.0[16]计算 Nei’s 遗传距离[17]。基于2 869个均匀分布的高质量SNP标记，利用Structure V2.3.3[18-19]判断所有自交系的群体结构。设置burn-in步长为10 000，MCMC迭代次数为100 000，对于每一个K值，分别进行16次独立的重复，研究材料的类群个数通过 ΔK确定[20]，多次运行结果用CLUMPP软件[21]整合。利用 Arlequin V3.11[22]计算AMOVA[23]和类群之间的遗传分化系数（Fst）。基于各类群自交系的Rogers（1972）遗传距离，利用NTSYS pc V2.10y软件中的Dcenter与Eigen模块对这些类群进行主成分分析，明确各类群自交系的分群特征。

2 结果

基于2 869个SNP位点分析的344份玉米种质的基因多样性为0.028—0.646，平均为0.442；PIC值为0.028—0.570，平均为 0.344（表 1）。2 869个 SNP标记中，有59.3%（1 702个）的SNP标记基因多样性处于0.45—0.50，具有较高的多态性水平。

2.1 群体结构

利用Structure软件对这些自交系的群体结构进行系统解析。当类群数（K值）在1—10变化时，对于每个指定的K值，LnP(D)值随着K值的增加持续上升，未出现明显的拐点（图1-a）；ΔK值在K=8时达到最大值（图1-b），表明344份自交系可以划分为8个类群。基于2 869个SNP标记分析研究材料的遗传组分在各个类群中的百分比，当以50%类群属性比率作为划分依据时，344份自交系中有235份（68.3%）被划分到8个类群中，而其余的109份（31.7%）则没有明确的类群归属特性（电子附表 1）。根据各类群所包含材料的系谱等信息，这8个类群依次确定为旅大红骨群（Lüda red cob，LRC）、黄改群（Huangzaosi improved lines，HIL）、Iodent群（Iodent，IDT）、兰卡斯特群（Lancaster，LAN）、X群（X group，X）、改良瑞德群（Improved Reid，IR）、瑞德群（Reid）和P群（P group，P）（图1-c、表1）。

在8个类群中，旅大红骨群、黄改群、Iodent群、兰卡斯特群、X群、改良瑞德群、瑞德群、P群各自包含21、37、17、23、24、35、39和39份材料，分别占总材料数的6.1%、10.6%、4.9%、6.7%、7.0%、10.2%、11.3%和11.3%。其中旅大红骨群、黄改群、兰卡斯特群、改良瑞德群、瑞德群、P群在前人研究中都有报道[8-13]，均为玉米育种中常用的杂种优势群；美国三大杂种优势群之一 Iodent种质在国内应用较少，近年有上升的趋势；X群是指利用外来新种质X1132X等作为基础材料选育而成的自交系群体。

2.2 群体分化及主成分分析

AMOVA结果表明类群间存在显著的遗传变异，占总遗传变异的38.6%，类群内的遗传变异为58.1%，自交系内的为3.3%。比较8个类群，遗传距离为0.229—0.514，Fst为0.319—0.512（表1）。各类群与X群比较，X群与兰卡斯特群、黄改群两者的遗传距离较大，与瑞德群、Iodent群之间的遗传距离较小。各类群与黄改群比较，黄改群与X群、兰卡斯特群、P群的遗传距离较大，与旅大红骨群之间的遗传距离较小。从遗传分化上来看，类群之间的关系也存在同样的趋势。

图1 344份自交系的群体结构分析Fig. 1 Clustering analysis of 344 inbred lines via the model-based method

表1 类群间遗传距离及遗传分化系数（Fst）Table 1 Genetic distances as measured by Nei’s distance (top diagonal) and pairwise Fst comparisons (bottom diagonal) between maize inbred groups

主成分分析结果显示，比例最高的3个主成分分别占总遗传组成的16.88%、15.13%和9.85%，取前3个主成分利用三维主成分图解释类群之间的遗传关系。从不同角度观察三维主成分图（图 2），瑞德群与兰卡斯特群处于三维图的两端，在种质资源实际的育种应用中，2个群之间可以形成强杂种优势；黄改群与旅大红骨群关系较近，二者均为中国地方种质选系、经过后续育种改良形成的群体，因此关系较近与实际情况相符；黄改群与X群、改良瑞德和兰卡斯特群关系较远，黄改群与以上3个类群均有很强的杂种优势，并在中国形成了很多大面积推广的品种，如京科968、郑单958等；X群与Iodent群关系最近，与黄改群、兰卡斯特群等遗传关系最远。以上结果和群间遗传距离有很高的一致性。

图2 根据遗传相似矩阵对344份玉米自交系进行主成分分析Fig. 2 Genetic relationship among 344 maize inbred lines revealed by principal coordinate analysis

2.3 群体遗传多样性

基于2 869个SNP位点分析的344份玉米种质的基因多样性为 0.028—0.646，平均为 0.442；PIC值为0.028—0.570，平均为0.344（表2）。不同类群的遗传多样性也存在一定差异，其中旅大红骨群、改良瑞德群、X群和黄改群具有较高的基因多样性（0.300、0.297、0.284和 0.274）和多态信息含量（0.243、0.241、0.228和0.226）；而 Iodent、兰卡斯特和瑞德等国外自交系的基因多样性（0.233、0.250和 0.247）和多态信息含量（0.193、0.209和0.202）则较低。

表2 类群的基因多样性和多态信息含量Table 2 Summary statistic of genetic diversity for model-based groups

2.4 位点多样性反应育种潜力和改良进程

品种产量水平提升的速度和潜力很大程度上取决于拥有种质资源的多样性程度。植物育种要求种质要有丰富的遗传变异[24]，但育种过程通常又会减少遗传多样性，随着商业育种的进行，自交系遗传基础狭窄的问题越来越突出，这使得在中国广泛种植的杂交种遗传脆弱性增加，大大增加对病虫害的发病风险，使农业生产面对越来越大的经济风险。由于群体大小和种质改良年代的限制，所有位点并不能全部表现出多态性，选取各类群的多态性位点，其遗传多样性水平一定程度上反映了种质育种潜力。随着种质改良的进行，群体遗传多样性将会有一定程度的衰减。本研究的结果也证明了这一点，对各类群的位点遗传变异程度进行比较分析发现（图3），改良历史较长的美国种质类群（兰卡斯特群、瑞德群、Iodent群）位点平均多态性水平最低；改良历史次之的国内地方种质旅大红骨群和黄改群位点平均多态性水平有一定程度的升高；20世纪70—80年代引入的美国商业化杂交种选系改良瑞德和 P群，位点平均遗传多态性进一步升高；近年选育的X群种质多态性最高。以上结果说明平均位点多态性和改良年代有很大关系，改良年代越长，类群遗传基础越狭窄，平均位点多态性越低。

种质改良会引入其他血缘材料，在供试自交系中，有很大比例的材料（31.7%）没有明确的类群归属特性，这些材料大多为育种改良过程中产生的中间材料，血缘成分比较复杂。以占比最高的遗传组分确定自交系的类群归属，当分别以20%、35%、50%和65%的遗传组分作为类群属性比率的阈值时，各类群材料趋向于保留最具代表性的种质，随着类群属性比率阈值的升高，位点基因多样性有着不同程度的降低（图4），其中美国种质类群（兰卡斯特群、瑞德群和Iodent群）和国内地方种质改良系（旅大红骨群和黄改群）代表性的材料多样性下降幅度较大，美国商业化杂交种选系P群和改良瑞德群下降幅度较小，而X群代表性的种质则没有下降趋势（图 4）。这种趋势也和育种改良年代相吻合，育种改良年代越久，群内代表性的种质多样性下降程度越明显，X群由于是近年来选育出来的优新种质，依然保留了很高的遗传多样性，未来还有很高的育种潜力可挖掘。

图3 8个类群的多态性位点基因多样性Fig. 3 Genetic diversity of polymorphism sites for 8 model-based groups

3 讨论

本研究所分析的344份玉米自交系，包含中国当前或历史上玉米生产中应用的重要种质资源，因为X群是美国杂交种选系，所以收纳了美国三大主要杂种优势群的代表系。从前人对中国玉米自交系的类群划分来看，不同研究在类群个数和类群之间的关系上存在一定的差异[7-12]。由于加入了近年来应用到育种中的新种质（X群种质等），类群个数和类群之间的关系和以前的研究有所不同，本研究群体结构分析将X群种质独立成群，并进一步对这一新的种质类群进行了系统的遗传分析。本研究引入的X群种质，近年在生产实践中获得很大成功，特别是北京农林科学院玉米研究中心坚持利用“高大严”选系技术选育出的京724、京725、京464、京MC01、D9H等一系列X群自交系，与黄改群种质京92和京2416组配杂交种，已经通过审定并在生产中大面积推广。X群具有良好的丰产性和抗逆性，同时也具有熟期合适、子粒脱水速度快等适宜机械化收获的优良性状[6]。

纵观中国玉米品种改良进程，品种水平的每一次大幅提高都与关键种质的发掘或引进密切相关。其中，从国外引入的自交系和国外商业杂交种选系起到了重要的作用，例如瑞德种质、兰卡斯特种质、改良瑞德种质、P群种质和X群种质等。把外来种质导入国内种质能有效增加遗传变异性，并产生更强的杂种优势[25]。中国玉米单交种最主要的杂优模式均属于国内种质×国外种质[26-27]。综合类群间遗传距离、Fst和PCA的分析结果，黄改群与X群、改良瑞德群和兰卡斯特群遗传关系最远，这三种杂优模式全部为国内种质×国外种质。经生产实践证明，黄改群可以与X群、改良瑞德群和兰卡斯特群形成强杂种优势，并已经培育出大面积推广的品种，其中利用X群×黄改群杂优模式，育成了京科968、京科665、NK718和京农科728等杂交种，此模式与郑单958、先玉335等中国已有推广品种的杂优模式均不同，是一种新型杂优模式。“X群×黄改群”杂优模式聚合了X种质的高配合力和黄改种质的强适应性，通过近年来育种实践和大面积生产证明，已成为中国玉米生产上快速上升的主要杂优模式。

国外种质资源可与本地资源形成优势互补，对中国玉米新品种选育作用巨大，但国内育种实践中应用的国外种质依然有限，仍有很多玉米种质需要育种家去挖掘，以形成更强的杂种优势，提高玉米产量，满足世界人口不断增长对粮食的需求。黎裕等[28]研究表明，到20世纪末，在45类美国基础种质类型中，有23类种质从未应用于中国玉米育种，同时还发现，与美国近代杂交种相比，中国品种含有较低比例的Iodent、Reid黄马牙等遗传组分。总体上中国玉米育种利用的基础种质类型仍然偏少，建议引入更多类型的种质材料，在中国玉米杂种优势利用模式下，进行育种价值的评估，以应用于中国玉米品种改良。主成分分析结果显示，X群种质与Iodent种质遗传距离相对较近，Iodent种质并未得到大规模的引进和利用，因此X群的成功引入和应用，拓宽了中国玉米育种实践对国外种质的利用。

图4 8个类群的位点平均基因多样性和类群属性比率阈值的关系Fig. 4 The relationship between genetic diversity of polymorphism sites and group attribute ratios for 8 model-based groups

4 结论

利用覆盖玉米全基因组的MaizeSNP3072芯片，对344份代表中国玉米育种种质资源基础的自交系进行全基因组扫描。群体结构分析将344份自交系划分为8个类群，分别为黄改群、瑞德群、兰卡斯特群、旅大红骨群、P群、改良瑞德群、Iodent群和X群，其中 X群与黄改群、兰卡斯特群遗传关系较远，与Iodent群遗传关系较近。类群的平均位点遗传多样性与改良年代关系较大，X群为近年来创新种质，位点平均多样性最高，可选择利用潜力大。X群和黄改群形成的京科968系列品种的杂优模式“X群×黄改群”为一种新的杂优模式，并正在成为中国玉米生产中的主要杂优模式。

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