羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与应用

沙娜瓦尔·塔希，买买提艾力·斯迪克，李 舵，王 文，美热木古丽·巴依待拉提，马晓燕，苏晓慧，盛卓君

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830001）

羊传染性脓疱又称为羊口疮，是由痘病毒科副痘病毒属的传染性脓疱病毒（Contagious pustular dermatitis virus，CPDV）引起的，主要感染山羊和绵羊的一种急性、接触性传染病[1]。该病在全世界范围都可发生，主要危害3～6月龄羔羊，一般呈群发性流行；成年羊也能够感染该病毒，但是一般不表现临床症状，且往往呈散发性[2-3]。患病羊主要临床症状为口腔黏膜、舌、唇等部位出现丘疹、红斑、水疱、脓疱，脓疱破裂继而发展成为烂斑，最后形成厚厚的疣状痂块[4]。这会导致患病羊出现采食困难，因营养不良而死去。患病羔羊在吮吸母羊乳头时可以通过皮肤感染母羊，继而母羊又传播至公羊，给养羊业造成一定的经济损失。

目前，国内对CPDV的检测大多采用电子显微镜检查（EM）、血清学检查、病原分离等[5]。这些检测方法存在操作时间长、过程繁琐、敏感性低等不足。并且CPDV引起的临床症状与山羊痘、口蹄疫等类似，如果再继发细菌感染，就很容易造成误诊[3]。本研究根据GenBank中公布的CPDV毒株序列，通过多毒株B2L序列保守区的比对，设计并合成1对特异性引物，建立了特异性PCR检测方法。采用此方法，对新疆维吾尔自治区南疆地区的部分疑似感染CPDV的羊群进行了检测，以验证该方法的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床待检样品 在新疆维吾尔自治区南疆地区喀什、阿克苏、和田、克州等区域采集的发病羊疑似病料。

1.1.2主要试剂 DL2000 DNA Marker、琼脂糖、Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）、RNase-free Water、DNA提取试剂盒：购自生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3引物设计与合成 根据GenBank中公布的CPDV毒株序列，通过多毒株（登录号分别为 AY386264.1、AY386263.1、DQ184476.1、HM133903.1）B2L序列保守区的比对，利用Primmer 5.0软件设计1对引物，预期PCR扩增核酸片段大小为436 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物：P1 5´-GGGTCCGCGTTCTTCCACTC-3´；下游引物：P1 5´-GGTCCGTGTCCACCATCAAG-3´。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸的提取 按照病毒核酸提取试剂盒操作说明书进行病毒核酸提取；提取之后将其置于4 ℃保存。对采集的羊唇部病变皮肤，首先用20 mmol/L的盐酸盐缓冲液进行洗涤；然后用高压灭菌剪刀剪碎，将其置于研钵中；用研磨棒充分研磨，加入一定量5%的双抗（青霉素和链霉素），再加维持液（MEM培养基中加入1%的双抗，用NaHCO3调节pH至7.0制备而成）稀释，3 000 r/min 离心10 min，取上清无菌过滤（用0.45微孔滤膜）；收集滤液并将其分装至离心管；取出200 µL进行DNA提取；最后将剩余滤液置于−20 ℃保存备用。

1.2.2PCR方法的建立 25 µL PCR反应总体系：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）12.5 µL，上下游引 物 各 0.5µL（20 µmol/L），DNA 模 板 2 µL，RNase-free Water 9.5 µL。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min。取PCR产物5 µL，在1%的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.3PCR扩增的特异性试验 用建立的PCR方法分别检测1.2.1中提取到的羊痘病毒、口蹄疫病毒、CPDV、小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒，以及健康羊组织，检测引物的特异性，同时用三蒸水作阴性对照。

1.2.4PCR扩增的敏感性试验 对CPDV模板DNA，用RNase-free Water连续作10倍梯度稀释；用上述已建立并优化好的最佳反应体系和反应条件进行PCR扩增，确定出现特异性扩增条带的最低DNA模板量。该模板量即为最低检出量。用核酸蛋白仪检测最初模板浓度并计算出最初模板量。

1.2.5临床样品检测 对采自新疆维吾尔自治区南疆地区喀什、阿克苏、和田、克州、巴州等区域发病山羊的48份疑似病料进行检测。

2 结果

2.1 PCR反应的最佳条件

结果显示：当退火温度为56 ℃时，目的条带最亮，且清晰无杂带（图1）；当引物量为0.6 µL时，目的条带最亮，且杂带较少，适合观察（图2）。因此，所建立的PCR检测方法的最适退火温度为56 ℃，最佳引物量为 0.6 µL。

2.2 特异性试验

将CPDV、羊痘病毒、口蹄疫病毒基因组DNA为PCR反应模板，按照本试验中优化好的反应体系和条件进行扩增，发现仅CPDV为模板的反应体系有大小约436 bp左右的条带，其他毒株模板的反应体系以及阴性对照组未见明显条带（图3），表明本试验建立的PCR检测方法具有高特异性。

2.3 敏感性试验

以CPDV DNA为样本，测定OD260nm值，计算模板DNA含量；将CPDV模板DNA进行10倍系列稀释，稀释10个梯度后进行PCR扩增。结果显示，当模板量为1 pg时（第7组）都可以扩增出大小为436 bp的目的片段（图4）。

图1 PCR反应退火温度梯度优化

图2 PCR反应引物优化

2.4 临床样品检测

对从新疆维吾尔自治区南疆地区部分区域收集到的48份临床发病羊疑似病料进行PCR检测，发现45份显示为CPDV阳性（图5），检出率为93.8%，说明该地区CPDV感染率较高，表明本试验建立的方法可以对临床样本进行快速、准确检测。

M. DL2000 DNA marker；1. 已知的CPDV样品；2. 采集的疑似发病羊病料；3. 羊痘病毒；4. 口蹄疫病毒；5.小反刍兽疫病毒；6.蓝舌病病毒；7. 健康羊组织；8. 阴性对照

图4 PCR方法灵敏度

3 讨论

传染性口疮病是羊群中的常见疫病之一，在大部分养羊国家曾发生过，在我国西北地区，尤其是新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区等养羊大省十分常见。该病在无继发感染情况下，死亡率一般较低，但发病率较高，容易在羊群中流行。该病的流行会使羊群繁殖性能受到影响，造成巨大经济损失。传染性口疮病的发病症状与羊口蹄疫、羊痘相类似，容易混淆而造成误诊[6]。

图5 临床样品检测

近年来，新疆维吾尔自治区的羊养殖规模不断扩大，但主要以散户、小型养殖户为主，大型规模化养殖场较少。在放牧过程中，羊容易被草料划伤唇部皮肤，并且小型羊场卫生条件较差，防疫措施较落后，户主又缺乏专业知识，因而容易将传染性口疮病与其他一些疾病，如口蹄疫、羊痘等混淆而造成误诊。对于轻微症状的羊如果不重视，疏于管理，就容易造成羊口疮反复发作，给养殖场带来巨大经济损失。因此，在羊养殖过程中，一定要做好羊口疮防控工作。首先养殖户主要足够重视，对于症状轻微羊只，既要细心照料，加强护理，又要改善羊舍环境卫生，保持羊舍清洁，及时清理羊舍粪便和其他异物，还要做好通风工作[7-8]；要做好疫苗预防，定期对羊群进行CPDV检测，不从发生过该病的疫区引种，从源头上杜绝羊口疮的传播与流行。

4 结论

本研究参考相关文献，对退火温度和引物浓度进行了优化，确定了最佳反应条件，通过对羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒，以及空白对照的扩增，表明建立的PCR检测方法具有较高的特异性。敏感性试验表明，样品DNA含量只有1 pg时，仍能扩增出特异性目的条带，说明该PCR检测方法具有较高的敏感性。

本试验建立的PCR试验方法只需提取病料中的DNA，利用所设计的特异性引物进行扩增，就可以扩增到相应的目的片段，具有高效、快速、特异性强等优点。用本试验所建立的PCR检测方法对临床采集样品进行检测，能够迅速检测出阳性样品，说明本试验建立的PCR检测方法适用于羊传染性脓疱的临床检测，对于新疆维吾尔自治区南疆地区羊CPDV感染的确诊和防控有重要意义。

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