东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡遗传多样性及系统发育地位

王玉涛, 潘建飞,黄翠翠,胡 平,韩建林,,*

1 喀什大学,生命与地理科学学院,喀什 844000 2 喀什大学新疆维吾尔自治区叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室,喀什 844000 3 中国农业科学院-国际家畜研究所畜禽牧草遗传资源联合实验室,北京 100073

雪鸡属鸟纲(Aves),鸡形目(Galliformes),雉科(Phasianidae),雪鸡属(Tetraogallus),包括高加索雪鸡(T.caucasicus)、里海雪鸡(T.caspius)、阿尔泰雪鸡(T.altaicus)、喜马拉雅雪鸡(T.himalayensis)和藏雪鸡(T.tibetanus)5个种[1-2],后3种在中国境内均有分布,其中喜马拉雅雪鸡又称暗腹雪鸡,藏雪鸡又称淡腹雪鸡。喜马拉雅雪鸡是雪鸡属中体形最大的种[3],在国内主要分布在昆仑山西部、祁连山脉和喜马拉雅山西部等地,按照分布格局不同又分为有4个亚种：即指明亚种(T.h.himalayensis)分布于我国新疆西部；疆南亚种(T.h.grombszewskii)主要分布于昆仑山西部向东到新疆于田附近；青海亚种(T.h.koslowi)分布于自阿尔金山西部向东经祁连山至青海湖南部地区；天山亚种(T.h.sewerzowi)分布于新疆天山山脉[3]。在国外,阿富汗、土耳其至尼泊尔、巴基斯坦和哈萨克斯坦均有分布[4-6]。昆仑山-帕米尔高原是喜马拉雅雪鸡的分布中心,然而由于全球气候变化、人类活动干扰、天敌侵害和非法狩猎,喜马拉雅雪鸡赖以生存环境不断恶化,群体数量急剧下降。喜马拉雅雪鸡现为国家Ⅱ级重点保护动物,已被IUCN红色目录列为低危(LC)物种[7],中国脊椎动物红色名录列为近危(NV)[8]。

雪鸡既具有较高的药用和观赏价值,又具有一定的生态价值。关于喜马拉雅雪鸡的研究主要集中在野外生境、巢址选择、食性和繁殖习性,圈养驯化和繁育以及起源进化方面[9-29]。在起源进化方面,刘强等利用雪鸡mtDNACytb基因全长序列(1143bp)与雉科中其他19个属的Cytb基因进行同源性比较,结果表明雪鸡属在雉科中与鹌鹑属亲缘关系最近,其次是石鸡属,雪鸡属与鹌鹑属的分歧时间为1.5百万—2.0百万年,与石鸡属分歧时间为1.7百万—2.4百万年[30]。Ruan等利用mtDNACytb基因部分序列(535bp)分析了6个喜马拉雅雪鸡群体,表明新疆天山地区雪鸡群体遗传多样性丰富,且群体间存在基因交流[31-32]。王小立通过对喜马拉雅雪鸡的线粒体DNA控制区(mtDNAD-loop)序列和微卫星进行标记检测,研究了我国喜马拉雅雪鸡11个地理种群的分子系统地理学,结果表明11个地理种群分为4个进化分支,且近期经历过种群分化、基因交流受到限制并且在冰期发生过扩张[33-34]。但以上研究中,涉及东帕米尔高原境内的喜马拉雅雪鸡样本数量较少或不足,不足以代表整个地理种群。因此,关于雪鸡地理学及遗传多样性研究,急需扩大样本数量以及地理覆盖度。

帕米尔高原是地球上两条巨大山带 (阿尔卑斯-喜马拉雅山带和帕米尔-楚科奇山带)的山结,也是亚洲大陆南部和中部地区主要山脉的汇集处,这里群山起伏、连绵逶迤、雪峰群立、耸入云天,因此人口稀少,人类活动较少,是野生动物理想的栖息地。但随着社会经济的飞速发展,人类活动加剧,帕米尔高原植被退化严重,荒漠化进程加速,野生动物栖息地生境破碎化程度严重[35],边缘效应加剧,物种内基因交流受阻,群体遗传多样性降低,导致该区域面临生物多样性丧失、生态系统服务低下和贫困的恶性循环[36],因此开展区域内生物多样性评估具有重要的意义。关于东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡群体遗传多样性评估及相关研究尚未见报道,因此为阐明东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡遗传多样性水平和系统进化地位,本文选择mtDNAD-loop序列信息,利用生物信息学软件分析雪鸡mtDNAD-loop序列特征和遗传多样性水平；选择GenBank中已提交的雪鸡序列,利用最大似然法构建系统进化树以及中介网络构建系统发育关系,这可为喜马拉雅雪鸡遗传资源保护和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

喜马拉雅雪鸡样本是从2008年开始在新疆帕米尔高原的塔什库尔干野生动物自然保护区(红其拉甫、达布达尔、恰拉奇古等区域)、阿克陶县和帕米尔雪鸡繁育基地收集雪鸡尸体的肌肉组织,合计25个。收集的肌肉组织放入75%酒精中-80℃保存,肌肉组织样本保存在喀什大学叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室。

1.2 基因组DNA提取

肌肉组织基因组DNA提取参照《分子克隆》(第三版)的提取方法,采用常规的酚·氯仿抽提法,并结合实验室条件进行了优化和改进。

1.3 引物设计和PCR扩增

利用Primer 5软件,根据GenBank上公布的雪鸡mtDNA序列(登录号：NC.027279)设计特异性扩增引物。正向引物L15725x-15705：5′-CCTAGCAGCCTCAGTACTCATCCTAC-3′,反向引物H1530x-1498：5′-CCGCGGTGGCTGGCACAAGATTTACC-3′,测序引物L15725-seq1：5′-CCTCTATTTTTCCCACAAAACTAGG-3′。 引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

PCR反应体系：总体积25μL,其中TaqDNA酶(500U)0.5μL,dNTPs(10mmol/L)0.5μL,Buffer(2.5mmol/L)12.5μL,上下游引物(10pmol/μL)1μL,DNA模板(100ng/μL)1μL,ddH2O 8.5μL。

扩增反应条件：94℃预变性3min,35个循环(94℃变性30s, 63℃退火30s, 72℃72延伸1.5min),72℃延伸7min,4℃保存。PCR产物采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。

1.4 序列分析

Chromas Version 1.45对喜马拉雅雪鸡mtDNAD-loop区序列进行人工校对。用MEGA 5.0比对序列以及统计序列碱基组成,并构建系统发育树。DnaSPV5用于统计单倍型,计算单倍型和核苷酸多样性指标,利用Adobe Illustrator软件对图片进行处理。利用Network4.6.1.1软件对本研究所得序列和GenBank下载的喜马拉雅雪鸡和藏雪鸡的同源mtDNAD-loop序列进行网络关系及其单倍型分布频率分析。喜马拉雅雪鸡和藏雪鸡序列信息见表1。

表1 雪鸡mtDNA D-loop序列信息表Table 1 mtDNA D-loop sequence information of Tetraogallus

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

图1 mtDNA PCR扩增产物Fig.1 Amplifications of mtDNA gene

对25份喜马拉雅雪鸡mtDNA目的片段进行PCR扩增,扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。检测产物大小与目的片段长度一致(2496bp),且条带清晰,无杂带或拖带,无非特异扩增产物,可以用于PCR产物直接测序。

2.2 mtDNA D-loop 序列分析

2.2.1 mtDNA D-loop核苷酸组成

对25个喜马拉雅雪鸡mtDNAD-loop区进行序列测定,测序结果经比较、矫正后获得了1157bp的全长序列。与参照序列NC027279进行对比编辑进行分析。结果表明：mtDNAD-loop中T、C、A、G 4种碱基平均比例分别为33.0%、26.2%、26.8%、14.0%,A+T的平均含量为59.8%,显著高于G+C平均含量40.2%。因此雪鸡mtDNAD-loop区富含A和T。进而说明碱基组成具有偏倚性,符合禽类线粒体DNA序列特征。

2.2.2 mtDNA D-loop核苷酸变异与单倍型多样性分析

利用DnaSP5.10.01软件对25个喜马拉雅雪鸡的mtDNAD-loop高变区进行单核苷酸多态性分析,以Hap1为标准,共检测到64个多态位点,占所测核苷酸的5.5%。其中有29个单一多态位点,位于第32、165、199、290、295、299、304、349、392、393、397、400、404、407、409、452、478、504、524、544、566、571、581、585、598、646、697、723和725位；33个简约信息位点,位于第146、166、168、173、189、205、208、217、218、220、222、223、231、236、237、242、243、245、256、289、383、554、573、576、578、606、609、714、740、780、826、838和1003位；240和953位存在两个插入/缺失位点。本实验检测到转换、颠换、插入或缺失4种核苷酸变异类型,其中转换42次,占变异位点数的65.63%,A/G之间转换8次,T/C之间转换34次；颠换20次,占变异为点数的31.25%；存在两处插入或缺失,在240处插入或缺一个C,在953处插入或缺失一个T。

通过DnsSP5.10.01软件对喜马拉雅雪鸡的25个个体mtDNAD-loop区序列进行多态性分析,结果共检测到64个多态位点,存在23种单倍型,命名为Hap1—Hap23(表2),25个雪鸡中有2个个体共享单倍型Hap11,2个个体共享单倍型Hap19,其余23个个体均为独立单倍型。平均单倍型多样度(Hd)为0.92±0.0001,平均核苷酸多样度(π)为0.00958,平均核苷酸差异度(K)为11.067,从而显示东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡核苷酸多样性较低,单倍型多样性高,具有较为丰富的遗传多样性。

表2 25个喜马拉雅雪鸡mtDNA D-loop 的23个单倍型变异序列Table 2 Sequence variation of 23 haplotypes in 25 Tetraogallus himalayensis group mtDNA D-loop

2.2.3 mtDNA D-loop区序列(1157bp)碱基变异和核苷酸多样性分布

利用DnaSP5.10.01软件分析高变区序列变异的位置(图2)。结果表明：喜马拉雅雪鸡mtDNAD-loop序列碱基变异的分布有很大的差异,在1—80bp之间较保守,在80—300bp之间变异较大,300—500bp相对保守,在500—700bp之间变异增大,700—1157bp相对比较保守,其中在230bp处的碱基变异最丰富。这一结果符合mtDNAD-loop的结构组成特点,5′末端为高变区I,突变率较高的中间区域为保守区域II,3′末端为高变区III。从而验证了扩增序列是来自mtDNAD-loop区域。对mtDNAD-loop序列核苷酸多样性分布分析(图3),结果表明：在碱基1—80bp之间保守,80—270bp之间核苷酸多样度较高,在270—500bp之间变异较少,500—700bp之间略微有所增加,在750bp之后逐渐趋于保守之势,在230bp处核苷酸多样度的值最大。核苷酸变异分布与核苷酸多样性分布基本一致。对mtDNAD-loop区序列(1157bp)错配分布分析(图4),表明东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡经历过群体扩张。

2.3 系统发育与网络关系分析

2.3.1 系统发育分析

结合本研究获得数据,下载GenBank已提交的雪鸡属mtDNAD-loop同源序列(886bp),比对分析共获得84个单倍型雪鸡(表1),利用MEGA6.1软件,采用Kimura-2模型,以邻接法构建其NJ系统发育树(图5),并对拓扑图进行自展检验,重复抽样次数为1000,然后以2条喜马拉雅雪鸡(GQ343551、GQ343550)的mtDNAD-loop同源序列作为根序列。

图2 mtDNA D-loop区序列碱基变异分布Fig.2 mtDNA D-loop base variation distribution

图3 mtDNA D-loop序列核苷酸多样度分布Fig.3 mtDNA D-loop nucleotide diversity distribution

图4 mtDNA D-loop碱基错配分布 Fig.4 Mismatch distributes for all Tetraogallus himalayensis samples

图5 84个雪鸡mtDNA D-loop单倍型构建的NJ系统发育进化树Fig.5 Evolution tree Tetraogallus constructs 84 mtDNA D-loop haplotypes in NJ tree

从图5系统发育树可以发现,84个单倍型共分为两大支。一支为喜马拉雅雪鸡,一支为藏雪鸡。而喜马拉雅雪鸡支又分为3支,本实验确定的23个单倍型喜马拉雅雪鸡聚在2个进化支上,其中19个单倍型与Wang等[35],Luzhang等[33]采集自塔什库尔干县样本(H32,H33,H34,AFXI-83)聚一个进化支上,可见来自东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡独享进化支,但单倍型Hap2、Hap17、Hap5、Hap15聚在另一个进化支上,进而说明该区域喜马拉雅雪鸡出现种群分化。

2.3.2 网络关系分析

Network网络分析法是系统进化分析最常用的方法之一,主要用于阐述种内水平的系统发育关系,能清晰地表明单倍型之间的关系、各单倍型在各群体中的分布频率及其基因流的方向。利用Network4.6.1.1软件对雪鸡mtDNAD-loop84个单倍型的网络关系进行分析(图6)。结果显示网络关系分析与其系统发育NJ树的结果完全一致,所有的单倍型聚为2个簇群,分别为喜马拉雅雪鸡簇群和藏雪鸡簇群。按照动物地理分布分析,本研究的19个单倍型与前人研究的4个单倍型聚在以东帕米尔高原为中心的喜马拉雅雪鸡簇中,且形成单独的一支,不与其他区域雪鸡共享进化支；其余4个单倍型与其他单倍型聚在以昆仑山、天山、阿尔金山和祁连山为分布区域的喜马拉雅雪鸡簇中。由此可见喜马拉雅雪鸡遗传特征具有明显的地理分布特征,并由此形成不同的亚种,说明雪鸡进化具有明显的地理起源特征。所有藏雪鸡均聚在以青藏高原为中心的簇中。

图6 84个单倍型网络关系Fig.6 Network relationship of the 84 haplotypes

3 讨论

3.1 遗传多样性

本研究喜马拉雅雪鸡25个样本获得1157bp长的mtDNAD-loop区序列,与其他鸟类控制区长度差异不大。喜马拉雅雪鸡碱基A+T的含量为59.8%,高于G+C的含量40.2%,证明雪鸡mtDNAD-loop区序列存在碱基偏倚性,符合鸟类线粒体DNA碱基组成偏倚性的特点。这与脊椎动物mtDNA的特点一样,存在一条重链和一条轻链,就是由于这两条链的A+T的含量差异造成的。共发现64个变异位点,占所检测核苷酸的5.53%,其中有29个单一多态位点,33个简约信息位点和两个插入/缺失位点,变异较高。

单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(π值)是衡量一个群体mtDNA 变异程度的两个重要指标。π值越大遗传多样性越高。本实验喜马拉雅雪鸡π值为0.00958,平均单倍型多样度为0.92±0.0001,说明东帕米尔喜马拉雅雪鸡核苷酸多样性低,而单倍型多样性较高,这与王小立对喜马拉雅雪鸡的11个地理种群67个样品的mtDNAD-loop的平均核苷酸多样性为0.0103±0.00523,单倍型多样性为0.977±0.00690结果一致[34]。安蓓对西藏雪鸡部分mtDNAD-loop控制区序列进行研究,结果表明藏雪鸡的核苷酸多样性(π值)为0.0036[37-38],由此可见,喜马拉雅雪鸡的核苷酸多样性高于藏雪鸡。研究认为降低物种遗传多样性的主要原因有：(1)种群间隔离:长时间缺乏基因交流；(2)栖息地破坏:自然种群栖息地片段化和严重近亲繁殖；(3)小种群遗传效应:遗传漂变、瓶颈效应和奠基者效应等[39]。由此推测出东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡可能由于缺乏基因交流和遗传漂变导致核苷酸多样性降低。鉴于此,喜马拉雅雪鸡作为国家Ⅱ级重点保护动物,国家林业部门应加强该物种的保护,建议：首先扩大位于东帕米尔高原的塔什库尔干野生动物自然保护区范围并建立国家自然保护区,恢复生态环境,提高雪鸡栖息地的适宜性；其次在东帕米尔高原原地建立雪鸡人工驯化繁育基地,借助分子遗传标记建立人工繁殖群体,以加强物种保护和利用；第三建立雪鸡捕杀惩戒制度,对于人为捕杀者偷食者进行严重惩戒。

3.2 系统发育

对喜马拉雅雪鸡和GenBank中雪鸡mtDNAD-loop共84个单倍型进行系统发育和网络关系分析,两者聚类分析结果一致,84个单倍型聚为喜马拉雅雪鸡簇和藏雪鸡簇。关于喜马拉雅雪鸡和藏雪鸡起源研究,包新康从种内亚种间分子系统发生关系、喜马拉雅雪鸡与藏雪鸡分歧时间的估算以及高原及其周边地质环境演变方面认定,喜马拉雅雪鸡和藏雪鸡是在高原隆升前(也就是说在3.6百万年前)就已经分化形成了,在青藏高原隆升初期的多瑙河冰期(3.5百万—2.6百万年),淡腹组雪鸡(藏雪鸡又叫淡腹雪鸡)的一支由天山东部地区向东南扩散至青藏高原东部地区的一些高山,伴随着青藏高原的隆升而形成藏雪鸡；暗腹组雪鸡(喜马拉雅雪鸡又称暗腹雪鸡)的一支形成喜马拉雅雪鸡后在高原隆升中期(大约0.88百万年前)开始向高原上扩散并形成各亚种[40]。王小立研究了我国11个地理种群喜马拉雅雪鸡系统发育,结果表明喜马拉雅雪鸡存在4个进化支,即昆仑山进化支、青藏高原进化支、天山进化支和喀喇昆仑山进化支,而喀喇昆仑山进化支为东帕米尔高原(塔什库尔干县)所独有,为独立进化支,不与其他地理群体雪鸡共享进化支[34],而本研究23个单倍型分布中19个单倍型(占84%)聚在以帕米尔高原为中心的进化支上,这与王小立研究结果一致。但本研究有4个单倍型不与喀喇昆仑山进化枝共享进化支,暗示了东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡经历过群体扩张,具有两个地理群体。帕米尔高原的群山起伏,连绵逶迤,冰川汇聚,雪峰群立,耸入云天,形成了独特的地理区域,作为生长在高海拔低温地区的鸟类,这里形成的地理障碍使得雪鸡基因交流受到限制,即形成独立的地理类群或亚种,这一点在本研究得到进一步证实。但东帕米尔高原喜马拉雅雪鸡是否经历过群体扩张,由于受样本数量的限制,尚需要进一步验证。

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