微栓塞球联合凝血酶粉栓塞法建立犬急性心肌梗死模型

金红峰 曾广忠 徐晨凯 王云龙 刘小伟 唐礼江

[摘要]目的通过微栓塞球联合凝血酶粉制剂栓塞冠状动脉制作Beagle犬急性心肌梗死模型的可行性以及安全性。方法选用体重10～12kg的30只Beagle犬经股动脉行左冠状动脉前降支造影，经微导管先把聚乙烯微球2ml（4x104/ml）悬浮制剂快速注入，随后注入凝血酶粉制剂2ml（1000u/ml）栓塞左前降支来建立心肌梗死模型。行心脏超声检查测量左心室舒张末内径（LVEDd）、左心室收缩末内径（LVEDs）、左心室射血分数（LVEF）等参数。结果

全部Bea-gle犬均行左冠状动脉造影成功，栓塞即刻成功率为83.33%，术中死亡率为16.67%，2周的存活率为70.00%。术后1小时心脏超声检查提示心脏前壁心尖部、室间隔前1/3收缩减弱，LVEF值明显下降。术后1周示左心室前壁出现节段性运动减弱及反向运动，LVEDd增大，LVEF值恢复正常范围。结论微栓塞球联合凝血酶粉制剂行冠状动脉介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作简单快速、动物创伤小、术后恢复快及成活率高，且具有可逆性等优点，是一种新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。

[关键词]心肌梗死模型；凝血酶粉；微栓塞球；冠状动脉栓塞

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是常见的致命性疾病之一，随着生活水平的提高，生活方式的改变，研究显示心肌梗死的发病率逐年升高。在心肌梗死研究中，动物模型被广泛用于发病机制和药物手术治疗研究。不同的动物模型制备过程适应不同的研究目的，心肌梗死动物模型的有效建立是完成相关实验的前提。目前心肌梗死的造模方法多采用开胸结扎法和介入栓塞法。开胸结扎法创伤大，恢复慢。随着冠状动脉造影、经皮冠状动脉介入等技术日益成熟，为避免开胸手术建立模型，且达到同样的效果，介入法建立心肌梗死模型的研究越来越多，本研究拟用微栓塞球联合凝血酶冻干粉联合栓塞冠状动脉法建立beagle犬的急性心肌梗死模型，并通过手术前后冠状动脉造影、实验室检查、心电图、超声心动图等检查验证造模是否成功。

1材料及方法

1.1实验动物：选择10～13月龄健康普通级Beagle犬30只，体重10～12kg的（均购自上海新冈实验动物场（许可证号：SCXK（沪）2012-0009），由浙江大学实验动物中心饲养），雌雄各半。

1.2实验仪器：C型臂x光机H5000：（荷兰，Philips）；超声多普勒诊断仪：（Philips Sonos 7500）；心电监护（Prucka Enginerring公司的多导生理记录仪器），Med-lab生物信号采集处理系统：（南京美易科技有限公司），心导管介入器械：BL 3.0 Guiding，Finecmss微导管、直径为0.036cm的导丝（0.014 inch Runthmughguidewire）、泰尔茂5F多功能造影导管，泥鳅导丝（均为日本Temmo公司产品）、Boston 2.0x20mm预扩球囊。微栓塞球（聚乙烯微球X直径90～125um）：美国Bangs Laboratories公司，凝血酶冻干粉（5000u）：浙江杭康药业有限公司（H33021734），碘普罗胺注射液（优维显）：上海旭东海普药业有限公司生产，戊巴比妥钠：北京普博斯生物科技有限公司。

1.3 Beagle犬心肌梗死模型的建立：30只Beagle犬，术前禁食12h，禁水4h，用3%戊巴比妥钠1ml/kg经左前足前静脉注射麻醉，控制静推速度，应先快后慢，观察犬反应程度“宁浅勿深”，根据实验犬对刺激反应程度调整戊巴比妥剂量。将犬仰卧位固定于导管床上，并将头部固定侧向右侧，保持呼吸道通畅，鼻导管吸氧（3L/min）。连接12导联体表心电图，记录心电图后，接模拟导联Ⅱ行心电监護。常规双侧腹股沟皮肤消毒、铺巾。于右侧股动脉搏动最强处用Seldinger法穿刺右侧股动脉，置入Terumo桡动脉鞘。经鞘管送入泥鳅导丝至主动脉窦底，沿导丝送入BL3.0 Guiding（日本Terumo公司产品）至左冠开口，左冠造影成功后，充分暴露前降支（1eft anterior desendingcoronary artery，LAD），以左头位暴露最佳。将导丝成功送至前降支远端，沿导丝送人Boston 2.0x20mm预扩球囊至LAD第二对角支处，以14arm扩张球囊，间隔30s分别先后行1、2、3min预缺血试验，观察心电监护心率变化。撤出球囊，沿导丝送入Finecross微导管（日本Terumo公司产品），微导管至LAD第二对角支远端，撤出导丝保留微导管在前降支位置不变，经微导管先把微栓塞球2ml（4×104个/ml）快速注入，随后经微导管注入凝血酶粉制剂2ml（1000u/ml，用0.9%氯化钠注射液配制）。观察5～10min后行冠脉造影确认血流是否阻断，如阻断，间隔30min、1h、2h、3h、6h、12h复查冠状动脉造影，了解血栓栓塞情况。1周后复查冠状动脉造影，需重复以上冠状动脉造影步骤，了解血管栓塞情况。结束手术后，拔出动脉鞘，穿刺口近端压迫30min，并用弹力绷带加压包扎，每间隔1小时观察穿刺点有无渗血血肿等。将实验犬运回动物中心，注意保温，待犬完全清醒后喂水，术后24小时解除穿刺点包扎，每日观察犬精神状态、进食量、穿刺处有无感染。

1.4心电图检查及心肌酶谱及肌钙蛋白测定：于术后1小时、6小时、12小时、24小时行心电图检查，每次连接心电图的位置固定不变，记录体表12导联心电图（ECG），以观察犬心肌梗死超急性期、急性期ECG变化。同时段经前足静脉抽取血液6ml分别装于医用常规管、生化管中，静至30分钟后，离心分离提取血浆、血细胞、血清保存至-80℃冰箱备用，由浙江医院生化室分析仪测肌钙蛋白I（cardiac tmponin，cTn-I）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）谷草转氨酶（aLs.oartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（～jutamicpyruvic transaminase，GFF又称ALT）。

1.5心脏超声检查：术前、术后1小时、6小时、12小时、24小时、3天、1周行心脏超声检查。取心脏四腔心及两腔心切面用Simpson法检测左心室射血分数（LVEF），取两者平均值。取胸骨旁左心室长轴切面，测得舒张末期室间隔厚度（interventricular septal depth，IVSd）、左心室舒张末内径（1eft ventricular end diastolicdiameter LVEDd）、左心室收缩末内径（1eft ventricularend systolic diameter，LVEDs）；并根据LVEDd、LVEDs计算左心室短缩率（FS），所有数据测量3遍，并取3次平均值作为超声心动图最终数据。

1.6统计学处理：应用SPSS19.0版统计软件，计量资料用（x±s）表示；手术前后的实验室检查指标及心功能指标采用配对t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Beagle犬心肌梗死模型的建立：全部Beagle犬均行左冠状动脉造影成功，未行右冠状动脉造影（图1A见封三）。术中有4只犬发生室性心动过速，心室颤动，3只死亡，1只犬经电除颤及抗心律失常治疗成功救活。其中2只犬是微栓塞球和凝血酶制剂推注完后3～5min出现心率加快，经多次除颤及利多卡因抗心律失常治疗后仍未抢救成功，1只犬是在3小时复查造影时出现室性心动过速，心室颤动，同样经抢救无效死亡，只有1只犬抢救成功并直至实验结束。2只犬在栓塞后出现心率逐渐减慢至30～40次/分，继而血压下降，经阿托品、肾上腺素及异丙肾上腺素抢救无效死亡。因此术中3只犬死于室性心动过速，室颤，2只犬死于缓慢性心动过缓，一共5只犬术中死亡。其余的4只术后死亡的犬分别死于术后7h、13h、2d、7d，其中1例出现穿刺点血肿，解剖后可见双侧肺部淤血，考虑可能因急性心力衰竭或失血死亡，具体原因不明。总的手术即刻成功25只，成功率83.33%，术中死亡5只，死亡率为16.67%，术后24h内死亡7只犬，术后2周内死亡9只犬（30.00%），2周的存活率为70.00%。所有犬因手术创口小均未出现创口感染。

冠状动脉栓塞前完善左冠状动脉造影；栓塞后30min、1h、2h、3h复查冠状动脉造影提示LAD近端全闭，无血流通过，6h复查冠状动脉造影提示近端血流再通，远端管腔仍完全闭塞；12h及1周后复查冠状动脉造影提示LAD血流再通，无明显狭窄（图1B、C、D、E、F见封三）。

2.2心电图检查：术前正常心电图，犬的12导联体表心电图，可见心电图所有导联的ST-T段均在基线水平，犬左冠状动脉前降支被堵塞后的12导联体表心电图中可见胸前导联的ST段明显抬高成弓背状。肢体导联上可见Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST-T段无明显抬高，其工、aVL导联可见ST-T轻度抬高。

2.3心脏超声资料：术前心脏超声检查示心脏收缩舒张功能及各阶段运动正常（图2A见封三），成功栓塞造成心肌梗死后可导致实验犬急性心力衰竭发作，心脏超声检查提示EF值下降明显，但术后3天后心功能开始恢复，至术后1周后EF值恢复正常范围，见表1。术后1小时检查提示心脏前壁心尖部、室间隔前1/3收缩减弱，EF值明显下降（图2B见封三）。术后3天检查示：左室前壁出现节段性运动减弱，LVDd增大，二维图像见左室腔扩大（图2C见封三）。术后1周示左室前壁出现节段性运动消失及反向运动等现象，梗死区出现心肌强回声，室壁变薄，LVEDd增大，EF值恢复正常范围（图2D见封三）。

2.4血生化检查：Beagle犬栓塞后心肌酶谱及cTnI的改变与人类相似，在术后6h已明显升高，12h左右达到峰值，24h后开始下降，符合心肌梗死的特点，见表2。

3讨论

在疾病研究中，动物模型的开发与应用是研究疾病发病机制和治疗手段的关键。随着介入技术的日益成熟，经心导管介入植入栓塞物或利用球囊等封堵冠状动脉阻塞血流，定位栓塞冠状动脉建立心肌梗死模型日益增多。介入封堵避免了开胸手术所造成的创伤，使死亡率明显下降，是临床研究心肌梗死比较理想的建模方法。

本實验全部Beagle犬均行左冠状动脉造影成功，微栓塞球联合凝血酶粉制剂能成功地阻断冠状动脉前降支血流，且血栓能维持6h～12h。

和以往的不可逆相比较，本实验的阻断血流是可逆性的，不过结合心电图、心肌酶谱、肌钙蛋白以及心脏超声等的结果，犬的心肌梗死是非常明确的。这也是一种新的心肌梗死模型。

成功栓塞造成心肌梗死后可导致实验犬急性心力衰竭发作，呼吸心率加快，心脏超声检查提示LVEF值下降明显，但术后3天后心功能开始恢复，至术后1周后LVEF值恢复正常范围。同时心超提示术后心脏前壁及心尖部出现阶段运动异常，1周后局部室壁瘤形成。血化验提示心肌酶及肌钙蛋白I较术前明显升高，可以确定利用微栓塞球联合凝血酶粉制剂行冠状动脉栓塞法能成功建立心肌梗死模型。术中有3只犬发生室性心动过速、心室颤动死亡，2只出现心率减慢传导阻滞死亡，4只死于术后2周内，总的手术成功率83.33%，2周的存活率为70.00%。

凝血酶粉制剂是由凝血酶冻干粉经0.9%氯化钠注射液配制而成，临床上多用于消化道出血、手术中不易结扎的小血管及外伤的止血。凝血酶粉是从牛血或猪血中提取的凝血酶原，经激活而得的凝血酶。进入血管能导致血栓形成，但在预实验时单就冠状动脉内注射凝血酶制剂较难形成血栓，实验中显示要平均注射15万单位时冠状动脉内血栓才会形成。但先在冠状动脉内通过微导管注射微栓球使血流减慢后，再缓慢通过微导管定位注射同样浓度的凝血酶粉制剂2000u就可使得冠状动脉内局部形成血栓。不能立即行冠状动脉造影检查，因凝血酶反应至形成稳定血栓需要时间，观察5～10min根据心电监护上实验犬的心率、心电图ST段抬高，此时考虑冠状动脉可能被完全闭塞。凝血酶冻干粉的特性需要直接与创面接触，在损伤的内膜上凝血效果比较好。使用球囊预扩张后，可导致局部的内膜损伤，注射微栓塞颗粒可阻塞冠状动脉微循环的作用，减慢血流，为凝血酶冻干粉注射形成血栓奠定基础。前期的预实验提示，如果单纯只打凝血酶粉，反复注射3次～5次才能形成血栓，且量较大，副作用更大，而先注射微栓塞颗粒后，再注射凝血酶冻干粉后，只需要注射1次凝血酶冻干粉就可快速形成血栓。

综上所述，微栓塞球联合凝血酶粉制剂行冠状动脉介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作简单快速、动物创伤小、术后恢复快及成活率高等优点，且无需使用呼吸机，可广泛应用于心肌梗死相关研究，极大地提高实验进程。微栓塞球联合凝血酶粉制剂封堵法是一种新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。