羊布鲁氏菌病4种血清学检测方法的临床应用比较

蔺旭光，史量全，李佳怡，郭双，张荣荣，白皓丞，李天旭，刘锴

1. 内蒙古民族大学动物科学技术学院内蒙古自治区肉牛疾病防控工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000；2. 通辽市园林管理局，内蒙古 通辽 028000

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患病，该病不仅造成饲养动物发病，如牛、猪、羊，还会感染水牛、麋鹿等野生动物发病，给养殖业带来严重的经济损失[1]。该菌为革兰阴性杆菌，多为光滑型菌株，兼性细胞内寄生[2]。患病动物可通过血液、空气等传播途径感染人发病，多数患病症状为全身酸痛无力、发烧，严重者还会导致不育，且治愈性较小，患病者终身携带。目前还没有人用布鲁氏菌病的特效疫苗，但已经有动物用疫苗且有良好的预防效果，如牛用S2和RB51，羊用M5，猪用S2等。动物感染布鲁氏菌病会导致流产、早产、死胎及木乃伊胎，公畜睾丸和附睾增大影响繁殖。流产的胎儿、胎衣和脐带等含有大量的致病菌，如不及时消毒处理，会造成同群动物感染。已鉴定出6种对陆生动物致病的布鲁氏菌，分别为B.melitensis、B.suis、B.abortus、B.canis、B.neotomae、B.ovis[3]。世界动物卫生组织(OIE)将布鲁氏菌病划分为B类动物检疫病。目前布鲁氏菌病还没有得到良好的控制，近些年来内蒙古许多地区养殖业布鲁氏菌病发病率较高且有上升的趋势，给公共安全卫生带来严峻的挑战。早期的检测预防是布鲁氏菌病较为有效的控制方法。关于布鲁氏菌病检测的常规方法主要有试管凝集试验(SAT)、玫瑰红染色试验(RBT)、虎红平板凝集试验(RBT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验(CFT)、胶体金免疫层析法等。分子生物学方法包括PCR、多重PCR、毒力基因PCR检测及16S rRNA基因测序[4]。日常布鲁氏菌病检测多通过两种以上的方法确诊。

荧光偏振分析(FPA)检测动物布鲁氏菌病是OIE指定检测方法之一，Nielsen等[5]提出通过布鲁氏菌OPS基因作为抗原标记异硫氰酸荧光素检测布鲁氏菌病感染血清，首次建立布鲁氏菌病FPA检测方法。FPA操作方法简单，仪器携带方便，成本较低，更适合田间操作[6]。本试验采用FPA法、SAT法、RBT法及IELISA法对内蒙古自治区采集的2 727份羊样本血清进行布鲁氏菌病检测，并比较检测结果，对内蒙古地区羊布鲁氏菌病进行流行病学调查。

1 材料与方法

1.1羊血清样本的处理 内蒙古自治区各集约化养殖场及散户养殖场随机挑选采集羊血样本共2 727份，每份羊血取1 mL置于离心机中3 000 rmp 10 min，弃沉淀取上清，4℃保存备用。

1.2试剂 布鲁氏菌荧光偏振测定法抗体检测试剂盒(哈尔滨平和生物技术有限公司)、间接ELISA试剂盒(IDEXX)、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监督所)。

1.3仪器 FLUPO荧光偏振检测仪(Explorer Cases)、Bio-Rad酶标仪、振荡器、高速低温离心机(Eppendorf)。

1.4方法

1.4.1IELISA 检测 参照IDEXX Brucellosis Antibody Test Kit 说明书进行操作。SAT法和RBT法按照产品说明书操做。确定荧光偏振仪器检测羊布鲁氏菌病血清阳性的临界值为75，高于判定为阳性，低于判定为阴性。试验结果采用SPSS 19.0进行数据统计分析。

1.4.2FPA检测 先对荧光偏振仪进行环境(包括温度、湿度)的矫正。仪器矫正完毕后再做试剂盒内阴性及阳性血清为对照。将2 727份血清每100份分为一组，共28组。每份血清取10 μL置于硼硅玻璃试管内，并与1 000 μL缓冲液震荡混合均匀后，将试管置于荧光偏振仪上，按顺序读取血清与缓冲液的初始Blank int.值。再将每个试管内加入10 μL布鲁氏菌标记抗原，震荡混匀后室温下孵育2 min，将试管再次置于荧光偏振仪上按照顺序读取sample int.值，显示sample mp值为最终检测值。

2 结 果

2.1不同方法检测羊血清的试验结果 IELISA、SAT、RBT及FPA四种方法分别对内蒙古自治区采集的羊血清进行检测，其检测的阳性率分别为7.59%、6.31%、6.20%及7.45%。IELISA与FPA检测的结果通过单因素ANOVA分析，P=0.226>0.05，说明两种方法对羊布鲁氏杆菌检测差异不具有统计学意义。SAT与RBT的阳性检出数相近，通过单因素ANOVA分析，P=0.319>0.05，差异不具有统计学意义。IELISA分别与SAT、RBT的检测结果通过单因素ANOVA分析，t值分别为1.270和1.383，且P<0.05得出IELISA与SAT、RBT差异具有统计学意义。同理FPA与SAT、RBT的t值分别为1.13和1.24，P<0.05。由此可见IELISA与FPA的样品阳性检出率总体比SAT和RBT高。

2.2FPA法检测散户与集约化养殖场的阳性率对比 FPA法检测的2 727份血清样本中，集约化养殖场血清样本数为1 165，散户样本数为1 562份。其中集约化养殖检出阳性样本数56份，所占比例为4.80%；散户检出阳性样本数为147份，所占比例为9.41%。集约化养殖场的阳性检出率比散户低。

3 讨 论

3.1内蒙古自治区羊布鲁氏菌病检出率及预防措施 养殖业是内蒙古自治区经济发展的支柱产业，布鲁氏菌病的存在和流行，严重影响养殖业的经济发展和人们群众的身体健康。近些年来各个国家的发病率也在增长[7]。本试验在内蒙古自治区随机采集的2 727份血清样本中，散户养殖发病率为9.41%，比集约化养殖场发病率高出近两倍，可见集约化养殖场检疫和防控的要求比散户养殖严格。在养殖的日常维护中，保持舍内卫生，做好通风消毒工作，定期给羊注射疫苗，如三联四防等，定期做布鲁氏菌病检测工作，并及时淘汰扑杀患布鲁氏菌病的羊，尸体要经过严格的处理，防止羊群再次感染。工作人员及饲养人员也要做好自我防护工作，定期检查身体，避免感染。

3.2FPA法与其他检查方法的比较 布鲁氏菌病的准确、快速检测是预防和控制该病的重要环节。传统的血清学检测方法存在漏检的弊端，有人为因素存在，且特异性与敏感性也不高，会不同程度影响诊断结果。目前国外多以FPA法和IELISA法对布鲁氏菌进行检测，且FPA法是OIE重要指定检测方法之一。FPA法与IELISA的生物学反应原理相似，IELISA的特异性与敏感性与FPA相近[8]。FPA法与IELISA法检测2 727份血清结果的差异不具有统计学意义。IELISA法虽有高敏感性高通量的优点，但不能区分检测疫苗抗体和野毒株抗体，且IELISA操作较为复杂，需要孵育等环节，耗时较长[9]。SAT及RBT法的特异性及敏感性远不如IELISA及FPA，差异具有统计学意义。SAT法主要检测抗体IgM，在检测时易被交叉反应干扰，RBT法易受到时间、温度及人为主观因素的影响，所以在检测时不准确易误诊。分子生物学PCR检测耗时较长，需要培养布鲁氏菌后提取核酸，对实验室要求较高，该过程耗时长容易感染操作人员，不适合大样本检测。

3.3FPA法的优势及展望 FPA法能区分疫苗抗体、野毒株抗体，操作简单，方便，携带方便，耗时短，成本低，检测迅速，避免二次抓捕，适合大样本检测及田间检测等。通过调整FPA的阈值可以对不同动物进行检测，是布鲁氏菌病较为理想的检测方法。虽然FPA方法在检测中有很高的特异性及敏感性，但也不排除该方法有假阳性、假阴性的存在，所以在诊断时需要配合两种以上的检测方法确认。未来随着FPA法便捷性的提高、检测费用的降低，该检测方法有望成为检测人员首选的检测方法。

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