△F508-CFTR在囊性纤维化治疗中的研究近况及前景

杨紫嫣,孙莹霄,董校汝,郑 岩,李荣霞,张超可,李雨澎综述,郝 峰审校*

(1.吉林医药学院，2.北华大学，吉林 吉林 132013)

囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)是一种常染色体隐性疾病[1]，同时也是一种致命性遗传病，系由囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变造成。全球7万多名CF患者中，白种人患病率最高[2]。同时根据各种临床资料显示，该病在我国也有一定的发病率。CF死亡率极高，和过去的几十年相比较，尽管CF患者的寿命已经有了明显的延长，但是到目前为止并没有发现完全安全及有效的治疗方法。最近几年，人们针对CFTR的结构、功能、与其他蛋白质的相互作用以及其在CF治疗中起到的作用这些方面都进行了广泛而深入的研究。

1 CFTR概述

1.1 CFTR结构

CFTR氯离子通道蛋白是ATP结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白超家族中一名成员，也是目前为止发现的唯一一个具有通道功能的家族成员[3-4]。根据研究发现，CFTR基因定位于人类的第7号常染色体长臂的q31-q32区上，CFTR基因全长为2.3×106bp，相对分子质量为168 173，包含27个外显子，通过核糖体编码翻译可以得到成熟的CFTR蛋白质，该蛋白质含有1480个氨基酸残基[5-7]。结构上，CFTR有两个跨膜区和两个核苷酸结合域(nucleotide binding domains,NBDs)。每一个跨膜区含有6个跨膜的袢，这6个袢组成了氯离子通道。NBDs可以调节氯离子通道的开闭[8]。跨膜区和NBDs是ABC超家族成员共同具有的特征。此外，CFTR还含有一个其他成员所没有的特殊的调节区R，该调节区R含有蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和PKC所共有的磷酸化位点以及许多带电氨基酸[9]。

1.2 CFTR氯离子通道的门控机制

CFTR主要通过两个NBDs来调节氯离子通道的门控性[10]。每一个NBDs都包含有一个保守的磷酸结合环，该磷酸结合环也被称为P环或者Walker A基序[11]，另外每一个NBDs还包含有保守的Walker B基序和LSGGQ基序。我们可以推测在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的结合和水解方面，这些结构域都发挥着至关重要的作用[12]。打开CFTR氯离子通道需要ATP的结合，抑制氯离子通道的开放则需要ATP水解成ADP。两个NBDs都含有ATP结合结构域，并且都具有ATP酶的活性，可以实现水解ATP来调节通道的开闭[13-15]。据最新研究表明，当NBD1和NBD2单独存在时，氯离子通道处于关闭状态。而当NBD1和NBD2紧密结合形成一个牢固的二聚体之后，氯离子通道则处于开放状态。而NBD1和NBD2这两个NBDs形成的二聚体中，只有NBD2具有水解ATP的能力，使氯离子通道打开[16]。这种现象表明在细胞中NBD1和NBD2通过各自的机制，实现对ATP水解以及门控的偶联过程。此外CFTR氯离子通道还含有一个特殊的调节区域(R-domain)[17]，该调节区R含有丰富的磷酸化位点，可以用PKA和PKC使得CFTR磷酸化，并且根据磷酸化程度的差异来控制通道的活性[18]。

2 △F508-CFTR与CF

CFTR基因突变的种类有很多。通过研究CFTR相关患者，发现到目前为止已检测出超过100种的CFTR氯离子通道突变类型。常见的类型有氨基酸删除(delta-F508、delta-I507等)、氨基酸代替(错义突变)、蛋白质合成提前终止(无义突变)和移码突变。此外还有内含子碱基突变影响外显子拼接，比如第3、10、12、13、16、19、20个内含子发生G-A突变。在上述的这些突变中，最常见的是CFTR蛋白第508位氨基酸缺失(ΔF508-CFTR)[21-22]。正常情况下，CFTR氯离子通道可以表达在细胞膜上，发挥氯离子通道的功能，将氯离子运输到细胞外，同时水分子因渗透压的作用也随氯离子一起被运输到细胞外。而在病理情况下，CF患者体内的CFTR功能出现异常，表达在细胞胞浆或者内质网中，无法表达在细胞膜上。这就导致细胞内的钠离子、氯离子和水分子不能正常的排出细胞，使得细胞内氯离子浓度升高，细胞外水分减少，大量黏液滞留。若发生在呼吸道则容易形成栓塞，造成呼吸道的阻塞。并且大量黏液滞留在呼吸道，容易造成细菌的大量繁殖，引起呼吸道感染。感染部位聚集的中性粒细胞会释放大量的蛋白酶，引起免疫介导的病变部位的炎症反应，长期呼吸道的感染与炎症反应最终会导致组织器官功能的衰竭[23]。ΔF508-CFTR这种突变的发生是由于蛋白发生了错误的折叠或是由于与分子伴侣相互作用的过程发生障碍，使ΔF508-CFTR表达在胞浆中而无法转运到细胞膜上。而且即使加入corrector使得ΔF508-CFTR定位到顶膜上，CFTR仍然没有氯离子通道的功能，还需要加入CFTR通道激活剂的作用才能使得CFTR恢复转运氯离子的功能[24]。所以筛选具有诱导ΔF508-CFTR蛋白质重新上膜和恢复转运氯离子的小分子，对于治疗CF具有重要意义[25]。

3 △F508-CFTR突变的治疗

CF治疗的传统方法都只能是针对临床症状的治疗，但随着CFTR基因的破译，针对CFTR的基因疗法给人们带来了希望。已有不少研究发现许多药物具有F508del校正器活性，其中包括4-苯基丁酸乙酯、米格鲁特、西地那非、辛二酰基酰替苯胺异羟肟酸、corr-4a、VRT-325、VRT-532等。但是由于该种药物对于F508del突变的校正率低且选择性差，因此也并没有进行更深入的研究及应用[26]。嘌呤受体亚型P2Y2激活剂denufosol四钠盐(INS.37217),是一种由美国Inspire制药公司研究开发的治疗CF的药物。该药物可以促进细胞内氯离子和水的分泌，黏蛋白的释放和纤毛摆动的频率，同时还能增强体内黏液的排除，与P2Y2受体的天然配体尿苷三磷酸具有相似的药理作用[27]。该药物对CF患者肺功能有明显改善，同时安全性较高。目前本品在美国已进入Ⅲ期临床研究阶段[28-29]。

Ivacaftor是由Vertex制药开发，于2012年FDA批准一种治疗CF的新药，其商品名为Kalydeco。该药可以帮助6岁及以上患者有效改善携带罕见遗传突变的CF患者的呼吸及肺部感染状况。Ivacaftor是首个针对CF病因和有缺陷的CFTR蛋白的靶向治疗药物。Ivacaftor作为跨膜转导调节因子CFTR的增效剂，通过作用于CFTR蛋白，延长该通道在细胞表面的开放时间，从而发挥治疗作用[30]。但是，通过一系列研究表明，Ivacaftor仅对因G551D突变类型的CFTR有效，对△F508-CFTR突变类型无显著效果。因此随后Vertex公司又研发出Lumacaftor(VX-809)，该药物对△F508-CFTR突变类型有较显著的效果，并且该药物还可以避免△F508-CFTR蛋白被降解。对该药物进行一系列的体外实验研究。研究结果表明：Lumacaftor具有较高的校正活性和选择性，理论上可以用来进行△F508-CFTR的校正，而且目前已经进行到临床研究阶段。通过一系列复杂的研究，2012年Vertex公司对外公布了关于Lumacaftor药效研究的实验数据，从研究结果可以看出:使用Lumacaftor药物治疗的实验组中的受试者肺功能均较安慰剂对照组受试者的肺功能有较为明显的改善。其中，当Lumacaftor剂量为600 mg时，Lumacaftor与Ivacaftor连用之后对于肺功能改善效果最佳。

4 总结与展望

CF是引起缺陷或缺少CFTR蛋白活性的寿命限性疾病。随着对CFTR的发病机制和临床表现的研究以及对CFTR基因的破译，为CF的治疗带来了个性化的改变。其中，联合使用Lumacaftor和Ivacaftor两种药物的组合疗法可以明显改善CF患者的呼吸及肺部感染状况,对于肺部CF患者的身体健康有很大的帮助。这种新型药物组合疗法仅在美国就可使得1.5万名患者受益。由于联合用药能从多个方面改善缺陷CFTR的功能，给患者带来的健康改善远大于单一药物的作用效果，所以这也将是未来CF药物研究的一个重要方向。

目前和未来的治疗目标主要集中在纠正CFTR蛋白的结构和功能异常方面。此外，一些改善症状的药物也在使用中。例如，通过激活Ca2+敏感的氯离子通道，使细胞内的氯离子和水分子排出细胞外，间接减轻了由于ΔF508-CFTR造成的呼吸道阻塞的临床症状，达到改善症状的目的。

[1] MUHLEBACH M S,CLANCY J P,HELTSHE S L,et al.Biomarkers for cystic fibrosis drug development[J].J Cyst Fibros,2016,15(6):714-723.

[2] WONG L H,LEVINE T P.Tubular lipid binding proteins (TULIPs) growing everywhere[J].Biochim Biophys Acta,2017,1864(9):1439-1449.

[3] TALWALKAR J S,KOFF J L,LEE H B,et al.Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Modulators:Implications for the Management of Depression and Anxiety in Cystic Fibrosis[J].Psychosomatics,2017,58(4):343-354.

[4] MUHLEBACH M S,CLANCY J P,HELTSHE S L,et al.Biomarkers for cystic fibrosis drug development[J].J Cyst Fibros,2016,15(6):714-723.

[5] SCHMIDT B Z,HAAF J B,TERESINHA L,et al.Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators in cystic fibrosis:current perspectives[J].Clin Pharmacol,2016,21(8):127-140.

[6] MORAN O.The biophysics,biochemistry and physiology of CFTR[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(1):1-2.

[7] CASTELLANI C,ASSAEL B M.Cystic fibrosis:a clinical view[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(1):129-140.

[8] SAINTCRIQ V,GRAY M A.Role of CFTR in epithelial physiology[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(1):93-115.

[9] MENG X,WANG Y T,WANG X M,et al.Two Small Molecules Restore Stability to a Subpopulation of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator with the Predominant Disease-causing Mutation[J].J Biol Chem,2017,292(9):3706-3719.

[10] HAQ I J,GRAY M A,GARNETT J P,et al.Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis:pathophysiology and therapeutic targets[J].Thorax,2015,71(3):284-287.

[11] HE L H,ALEKSANDROV A A,AN J L,et al.Restoration of NBD1 thermal stability is necessary and sufficient to correct ΔF508 CFTR folding and assembly[J].J Mol Biol,2015,427(1):106-120.

[12] WANG Y T,WRENNALL J A,CAI Z W,et al.Understanding how cystic fibrosis mutations disrupt CFTR function:from single molecules to animal models[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,52(1):47-57.

[13] BOZOKY Z,KRZEMINSKI M,MUHANDIRAM R,et al.Regulatory R region of the CFTR chloride channel is a dynamic integrator of phospho-dependent intra- and intermolecular interactions[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(47):4427-4436.

[14] XIN M,CLEWS J,KARGAS V,et al.The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and its stability[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(1):23-38.

[15] COHEN-CYMBERKNOH M,KEREM E,FERKOL T,et al.Airway inflammation in cystic fibrosis:molecular mechanisms and clinical implications[J].Thorax,2013,68(12):1157-1162.

[16] CALLEBAUT I,HOFFMANN B,LEHN P,et al.Molecular modelling and molecular dynamics of CFTR[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(1):3-22.

[17] CIL O,PHUAN P W,LEE S,et al.CFTR activator increases intestinal fluid secretion and normalizes stool output in a mouse model of constipation[J].Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2016,2(3):317-327.

[18] JIH K Y,HWANG T C.Vx-770 potentiates CFTR function by promoting decoupling between the gating cycle and ATP hydrolysis cycle[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(11):4404-4409.

[19] OZEN ALAHDAB Y,DUMAN D G.Pancreatic involvement in cystic fibrosis[J].Minerva Med,2016,107(6):427-436.

[20] Hanukoglu I,Boggula V R,Vaknine H,et al.Expression of epithelial sodium channel (ENaC) and CFTR in the human epidermis and epidermal appendages[J].Histochem Cell Biol,2017,147(6):733-748.

[21] GRAY R D,MCCULLAGH B N,MCCRAY P B.NETs and CF Lung Disease:Current Status and Future Prospects[J].Antibiotics (Basel),2015,4(1):62-75.

[22] DWYER M,SHAN Q,D’ORTONA S,et al.Cystic fibrosis sputum DNA has NETosis characteristics and neutrophil extracellular trap release is regulated by macrophage migration-inhibitory factor[J].J Innate Immun,2014,6(6):765-779.

[23] DAVIES J C,CUNNINGHAM S,HARRIS W T,et al.Safety,pharmacokinetics,and pharmacodynamics of ivacaftor in patients aged 2—5 years with cystic fibrosis and a CFTR gating mutation (KIWI):an open-label,single-arm study[J].Lancet Respir Med,2016,4(2):107-115.

[24] CHOTIRMALL S H,MCELVANEY N G.Fungi in the cystic fibrosis lung:bystanders or pathogens?[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,52(1):161-173.

[25] CALLAGHAN M,MCCLEAN S.Bacterial host interactions in cystic fibrosis[J].Curr Opin Microbiol,2012,15(1):71-77.

[26] LUNDMAN E,GAUP H J,BAKKEHEIM E,et al.Implementation of newborn screening for cystic fibrosis in Norway.Results from the first three years[J].J Cyst Fibros,2016,15(3):318-324.

[27] IKPA P T,BIJVELDS M J,DE JONGE H R.Cystic fibrosis:toward personalized therapies[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,52(1):192-200.

[28] CHADWELL K.Clinical practice on the horizon:personalized medicine[J].Clin Nurse Spec,2013,27(1):36-43.

[29] Green D M.Cystic fibrosis:a model for personalized genetic medicine[J].N C Med J,2013,74(6):486-487.

[30] 方耀敏,姜文华,李亚秋,等.CFTR在小细胞肺癌中表达及其意义的研究[J].吉林医药学院学报,2013,34(5):321-323.