汉防己甲素对钛颗粒诱导PBMC免疫成熟的影响

田节印，赵丽

（邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002）

0 引言

随着我国进入老龄化社会，骨性关节炎的发病逐年增高，而目前骨关节炎的有效手段仍是人工关节置换术[1]，尽管人工关节的材质及设计一直不断在改进，但假体无菌松动仍是影响人工关节使用寿命的最主要原因之一[2-3]，而且发病率居高不下。汉防己甲素是一种双苄基异喹啉生物碱，具有抗炎、抗高血压及抗肿瘤等作用，已广泛应用于临床各个疾病的治疗[4-5]。我们选择观察汉防己甲素对钛金属颗粒刺激PBMC释放IL-12和干扰素-g的情况作为研究对象，探讨汉防己甲素对钛颗粒诱导PBMC免疫成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

健康志愿者采集肘静脉血，肝素抗凝。采用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMC）。淋巴细胞分离液，10%小牛血清RPMI1640，Hank's液，钛颗粒（Alfa Aesar公司），IL-12、INF-g酶联免疫吸附剂测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、汉防己甲素（临汾药业有限公司）。

1.2 实验仪器

DHC-1300-RA-BR超净工作台（苏州净化公司），PCR仪（BD公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

1组为阴性对照组，PBMC+培养基；2组为空白对照组，PBMC+生理盐水；3组阳性对照组，PBMC+0.1%钛颗粒；4组为汉防己甲素组，分离PBMC+0.1%钛颗粒+1g/mL汉防己甲素。

1.3.2 细胞分离及活力检测

将采用Ficoll密度梯度离心法获得的外周血单个核细胞加入5倍以上体积的Hank¢s液，1500rpm×10min，洗涤细胞两次，末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞，取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼蓝染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数计细胞活力检测，活细胞百分率在95%以上。

1.3.3 钛颗粒悬液配制

将钛颗粒用乙醇浸泡消毒后，用无菌PBS配成浓度为0.1%的悬液，用鲎试剂证实无内毒素后储存在4℃冰箱备用。

1.3.4 培养上清液中的IL-12和干扰素-g水平检测

采用双抗夹心ELISA法，检测各组上清液标本中IL-12、INF-g水平，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0软件对所得数据进行统计分析，各组上清液标本中IL-12、INF-g含量的组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

ELISA法检测培养上清液中的细胞因子显示，与阴性对照组和空白对照组相比，促炎细胞因子IL-12和干扰素-g的量明显增多（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组的IL-12和INF-g的表达无明显变化（P＞0.05）；经汉防己甲素干预后，与3组相比，可显著降低培养上清液中的炎性细胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05），见表 1。

表1 各组对PBMC表达IL-12及INF-g的影响

表1 各组对PBMC表达IL-12及INF-g的影响

与1组相比，*P＜0.05；与3组相比，…P＜0.05。

25.85±2.73 30.59±11.63 86.49±14.04*57.26±6.84…组别 IL-12含量（pg/mL） INF-g含量（pg/mL）1组2组3组4组13.55±0.56 14.02±0.03 23.16±0.12*19.23±0.01…

3 讨论

研究表明，人工假体磨损颗粒释放的金属离子刺激假体周围界膜中的细胞而释放出大量炎症因子[6]，影响免疫细胞如单核巨噬细胞、淋巴细胞等的功能参与假体周围骨溶解导致假体的无菌性松动。根据研究结果，理论上可以选择抑制免疫细胞功能的药物来预防无菌性松动。汉防己甲素是双苄基异喹啉类生物碱，具有广泛的药理作用。已有研究表明汉防己甲素可降低炎症因子的表达[7]。本研究通过体外观察钛颗粒对PBMC表达免疫炎性因子IL-12、INF-g的情况及汉防己甲素对其影响，探讨汉防己甲素预防人工关节无菌松动的可能。

研究结果显示与阴性对照组和空白对照组相比，促炎细胞因子IL-12和干扰素-g的量明显增多（P＜0.05），而阴性对照组和空白对照组的IL-12和INF-g的表达无明显变化（P＞0.05）；经汉防己甲素干预后，与3组相比，可显著降低培养上清液中的炎性细胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05）。提示钛颗粒确可作为刺激因子促进免疫炎性细胞PBMC的成熟，并释放大量炎性因子IL-12和INF-g，影响关节松动的发生；汉防己甲素可通过抑制免疫炎性细胞成熟，抑制释放炎性因子，从而预防关节松动的形成。

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