一例猪瘟和链球菌混合感染的诊断

丁宝光，露 娜，陈雪龙*

（1.黑龙江鹤岗市萝北县宝泉岭农场，黑龙江 鹤岗 154211；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

近年来，我国养猪业发展迅速，从国外引进种猪的品种和数量增多。加之饲养管理不当，猪病的动态越来越复杂，猪病以病原的多重感染和混合感染为主要流行形式，猪病群发病往往不是由单一病原所致，而是以两种以上的病原体相互协同作用所造成的，常常导致猪群的高发病率和高死亡率，危害严重。细菌的混合感染主要涉及猪链球菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。

猪瘟俗称“烂肠瘟”是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性[1]。常常与一种或几种细菌、病毒、原虫混合感染或继发感染[2]，1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。中国大部分省份都有发生。1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属中的猪瘟病毒[3]。主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。

猪链球菌病是集约化养猪场的主要传染病之一， 世界各地均有发生，20 世纪90 年代以前， C 群和D 群的马链球菌兽疫亚种是我国猪链球菌病的主要病原。各年龄段的猪都可感染此病， 但多发于3～12 周龄的猪，尤其是断奶仔猪易感染此病。由于目前还没有十分有效的疫苗， 因此该病还在世界范围内广为流行， 严重危害养猪业的发展。

本文通过对大庆市某猪场送检仔猪的病理解剖和实验室诊断，确诊这一病猪发病原因是该猪同时感染猪瘟病毒和链球菌，现将诊断过程汇报如下。

1 材料与方法

1.1 病料

大庆地区某猪场送检病猪的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等。

1.2 试剂

Marker DL 2000 购自大连宝生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒购自TIANGEN公司，PCR Master Mix 缓冲液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒购自QIAGEN公司，RevertAid F irst Strand cDNA Synthesis Kit 反转录盒购自MBI公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

根据GenBank中已发表的猪巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒基因序列设计特异引物。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 细菌分离培养

无菌剪取一小块深部组织脏器，接种涂抹于5%兔血琼脂培养基上，分别做需氧和厌氧培养，置37 ℃ 恒温箱中24 h，同时用接菌环挑取肠内容物接种在伊红美蓝和麦康凯培养基上，置37 ℃恒温箱中需氧培养24 h，观察菌落形态和溶血情况等，挑取疑似菌的单个菌落进行纯培养。

表1 引物设计

1.5 核酸的提取及鉴定

1.5.1 组织DNA和RNA提取

按照TIANamp Genomic DNA Kit操作进行提取DNA；按照 RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒进行提取RNA，-20 ℃保存备用。

1.5.2 RNA反转录和PCR扩增

按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒说明书操作步骤将病毒提取的RNA进行反转录，得到的cDNA 在-20 ℃进行保存备用。

1.6 药敏试验

将鉴定为链球菌的纯培养物用接种棒均匀涂布在鲜血培养基上，将药敏纸片分别贴于平皿中，37 ℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果[4]。

2 结果与分析

2.1 临床症状

整群猪精神萎顿、食欲不振，发病猪只喜卧不动，嗜睡，体温升高（最高达40.5℃），呼吸困难、急促、结膜发绀。尿液发黄，粪便呈算盘珠样，也有稀便，粪便中混有肠黏膜。四肢内侧及腹部有紫色红斑，耳尖发紫。运动失调。有的不能站立，或爬行，病程3～5 d，衰竭死亡。

2.2 病理学诊断

经剖检，病死猪多呈现多发性出血性为特征的败血性病变。淋巴结呈急性炎症变化，淋巴结肿胀，外观呈深红色至紫黑色，切面周边出血，切口外翻；肝脏肿胀、颜色变浅、质地变脆；肾脏实质性病变，色泽变浅，可见包膜下有针尖状出血点，遍布整个肾脏表面；切开肾脏，可见皮质层、髓质层、肾乳头及肾盂黏膜上均有数量不等、大小不一的点状出血；脾脏表面有微隆起的梗死病灶，呈紫黑色，数量不等，大小不一，个别有黄豆粒大小，质脆；胰腺肿大、出血；胸腹水增多，心肌松驰，心冠脂肪有小出血点；十二指肠溃疡，有钮扣状出血灶、坏死灶；胃黏膜充血，脱落，有出血点；回盲瓣附近淋巴滤泡坏死、溃烂；关节肿胀，滑液混浊，关节囊内有黄色胶冻样液体，关节液增多，个别出现关节软骨坏死，关节周围组织有多发性化脓灶。

3 实验室诊断

3.1 革兰氏染色

将病料中所分离的细菌进行纯培养，然后对其革兰氏染色、涂片、镜检[5]。可见蓝紫色的链状或成双排列的球菌，疑似链球菌。

图1 细菌革兰氏染色10×10倍光学显微镜照片

3.2 PCR结果

PCR结果见图2。

图2 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳分析

如图2所示，第1孔在28 0bp左右有一条带，与猪瘟病毒片段相符；第6孔在689 bp左右有一条带，与链球菌片段相符。

3.3 药敏试验结果

表2 药敏结果

4 讨论

4.1 发病原因

对该猪场仔猪的发病原因进行调查。发现该猪场疫苗免疫不到位或免疫程序不科学：未作免疫，或疫苗运输、保存、使用不恰当，造成免疫效果差或无效。消毒不到位：链球菌病多由外伤感染引起。如器械、环境消毒不严造成伤口感染，仔猪的断脐、断尾，三至四日龄的补铁、补硒注射，阉割，疫苗的免疫注射等操作过程中消毒不严造成感染。防范不到位：猪瘟病毒侵入猪场、患有免疫抑制性疾病、猪病原虫感染加之防治不到位，造成继发感染等[7]。

4.2 防治措施

做好疫苗免疫注射工作。母猪配种前要做好猪瘟疫苗的免疫，每次产后20 d可随未做超免的仔猪按4个剂量的兔化猪瘟弱毒疫苗加强免疫1次；仔猪在猪瘟流行期间可做超免，未做超免的20日龄按2个剂量免疫注射，55～60日龄按4个剂量加强免疫1次。母猪产前20 d免疫链球菌病灭活苗1次，仔猪20日龄免疫链球菌病灭活苗1次[8]。

做好消毒防范工作。搞好环境卫生，严格执行消毒制度，健全兽医卫生防疫制度并执行到位，对猪体伤口要及时消毒处理，以防感染，严防猪瘟病毒传入猪场。

做好药物保健。每隔1～2周用蓝圆热毒清（抗毒、杀菌、提高免疫力的中药提取剂）按0.2%的比例拌料2 d，圆蓝五肽（提高免疫力的中药多肽提取剂）100 mL加水25 kg让猪自由饮用2 d。

落实“五早”措施。对猪病要早发现、早诊断、早治疗、早隔离、早灭原，尽早净化猪场[9]。

5 结论

通过对该病死猪的病理解剖和实验室诊断，确诊送检的病死仔猪死亡原因是该病猪感染了猪瘟病毒和链球菌。

[1] 卢景华. 猪流行病难治原因及其解决对策[J].当代畜牧，2014(15)：11-12.

[2] 侯友. 近几年猪流行病的发生特点及防治对策[J].山东畜牧兽医，2009(3)：23-25.

[3] 徐建民，周光斌. 猪瘟和链球菌病混合感染的诊断与防治[J]. 中国畜牧兽医文摘，2011(3)：148.

[4] 郝春燕，王利勤，王晶钰. 猪链球菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 动物医学进展，2010(5)：124-128.

[5] 李彦华. 革兰氏染色原理[J]. 辽宁工程技术大学学报， 2006，25 (S2)：335-336.

[6] 尹燕博，徐瑞，李葳，等. 猪链球菌病病原和病理学诊断[J]. 中国动物检疫，1997（3）：3-5.

[7] 郭志霞. 猪瘟临床症状及防控措施[J].中国畜牧兽医文摘，2013，29（3）：94.

[8] 刘国清.试论猪流行病的发病原因与防控对策[J].农民致富之友，2013（20）：186-189.[9] 杨新立，武文海. 猪瘟和链球菌病混合感染的诊治[J]. 今日畜牧兽医，2013(10)：30-31.