脂联素基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

林峰芳孙 霞 张玲云

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种多基因遗传病，国内外学者针对其遗传特点展开了大量研究，但是并未发现有与PCOS发病直接相关的基因[1-2]。近年来脂联素基因（ADIPOQ）与PCOS的相关性成为研究的热点，已经发现的ADIPOQ单核苷酸多态性位点包括rs1501299和rs2241766[3]，研究[4]显示这两个多态性位点与糖尿病、心血管疾病、肥胖等相关，也有研究[5]显示这两个多态性位点与PCOS相关，但尚存争议。另外有报道[6]称ADIPOQ的另两个多态性位点rs17300539和rs12495941与脂联素水平有关，但鲜有其与PCOS的相关性报道。本研究通过分析PCOS患者与不孕不育对照组患者 ADIPOQ的 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四个单核苷酸多肽位点的基因型和等位基因频率分布的差异探讨ADIPOQ多态性与PCOS的相关性，为研究PCOS的发病机理提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选择2012年3月—2016年10月奉化区妇幼保健院收治的多囊卵巢综合征患者65例，平均年龄（27.85±4.18）岁，体质指数（BMI）（25.45±3.87）kg/m2。多囊卵巢综合征的诊断标准[7]：（1）偶发排卵或者没有排卵；（2）临床生化指标显示雄激素过多症；（3）卵巢多囊样改变：B超检查显示卵巢体积增加10mL以上，至少有一侧的卵巢的直径在2～9mm卵泡在12个以上。另外根据研究组患者的年龄、BMI等随机选择同期在我院就诊的不孕不育患者60例作为对照组，平均年龄（27.79±6.25）岁，BMI（25.41±4.13）kg/m2。该组患者主要是由于男方因素或者输卵管因素导致不孕。两患者年龄、民族、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。排除标准：有分泌雄激素肿瘤；先天肾上腺皮质增生；Cushing综合征；有吸烟、酗酒等不良习惯的患者；有甲状腺疾病、高血压、心血管疾病、糖尿病等患者；近半年内服用过避孕药、促排卵药物、雄激素药物、糖皮质激素、高血压药物等的患者。本研究获得了奉化区妇幼保健院医学伦理委员会的批准，每位参与研究的患者均签署了知情同意书。

1.2 方 法 采集所有研究对象的空腹静脉血约4mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用全血基因组抽提试剂盒抽提基因组DNA，试剂盒为QIAamp DNA抽提试剂盒（Qiagen，编号51183），抽提后使用50μLddH2O洗脱。PCR扩增相应的基因位点，rs17300539位点设计的引物序列（软件为Primer Premier 6.0）为：上游 5’-ACTCTGCTGAGATGGACG GA-3’；下游上游 5’-GGGATGAGGGTGAAGATGG G-3’。rs1501299位点设计的引物序列为：上游5’-GGCCTCTTTCATCACAGACC-3’；下游上游5’-AGA TGCAGCAAAGCCAAAGT-3’。rs2241766 位点设计的引物序列为：上游5’-GAAGTAGACTCTGCTGAGAT GG-3’；下游上游 5’-TATCAGTGTAGGAGGTCTGTG ATG-3’。rs12495941位点设计的引物为：上游5’-T AGTGAGCCGAGATTGTGC-3’；下游 5’-TCCTTAGG CATGTAGCTTTCC—3’。PCR 扩 增体系为：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5μL，dNTP mix 5μL，上下游引物各 1μL，TaKaRa LA Taq（5U/μL）0.5μL，模板 DNA2μL，ddH2O35.5μL，总体积 50μL。PCR 扩增反应程序：95℃，5min；94℃，30sec；60℃（rs2241766）或者 58℃（rs17300539、rs1501299、rs12495941），30sec；72℃，45sec；35个循环后 72℃延伸 10min。将 PCR 扩增后的产物纯化后送上海桑尼生物科技有限公司测序，根据测序结果判定等位基因和基因型情况。

1.3 统计学方法应用SPSS20.0软件，计数资料表示方法为[n（%）]，采用 χ2检验，应用 Logistic 回归分析基因型的OR值，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs17300539位点基因型和等位基因频率比较

研究组和对照组rs17300539位点基因型之间的差异有统计学意义（χ2=6.85；P=0.03），且研究组患者rs17300539位点A等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.38；P=0.04），rs17300539 位点AA基因型患者PCOS的风险显著高于GG基因型（OR=3.15，P=0.00），见表 1。

2.2 rs1501299位点基因型和等位基因频率的比较

研究组和对照组rs1501299位点基因型之间的差异有统计学意义（χ2=7.75；P=0.02），且研究组患者rs1501299位点C等位基因频率明显高于对照组，A等位基因频率明显低于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.38；P=0.04），rs1501299 位点 CC 基因型患者PCOS的风险显著高于AA基因型（OR=2.75，P=0.01），详见表 2。

2.3 rs2241766位点基因型和等位基因频率的比较研究组和对照组rs2241766位点基因型之间的差异无统计学意义（P＞0.05），两组rs2241766位点T等位基因和G等位基因频率之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表 3。

2.4 rs12495941位点基因型和等位基因频率的比较

研究组和对照组rs12495941位点基因型之间的差异无统计学意义（P＞0.05），两组rs12495941位点G等位基因和T等位基因频率之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表 4。

3 讨论

PCOS是由多个基因控制的遗传病，能够影响机体组织、细胞的功能，严重影响患者的生命健康，研究PCOS的遗传学特性成为学者关注的焦点[8]。目前研究发现，主要是一些参与调控生育的基因与PCOS的发病相关，例如与促性腺激素有关的基因等[9]。另外，临床研究[10-11]显示，由于与PCOS的发病相关的基因具有多态性，因而其临床表现也呈现多样性。近年来关于ADIPOQ基因多态性位点的研究也成为热点之一，这其中以 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四个单核苷酸多肽位点为主，但是由于受到人种、地域的差异以及样本量的影响，研究结果并不一致[12-13]。

3.1 rs17300539位点与PCOS相关性分析 rs17300 539位点位于ADIPOQ基因的启动子区域，相关研究显示该区域主要与高血压、糖尿病等相关疾病的发病有关[12]。有研究[14]显示，rs17300539基因位点与肥胖的发生相关，研究[15]显示rs17300539与胰岛素的分泌水平和血清脂联素的分泌水平相关，从本研究结果中可以看出，研究组患者rs17300539位点A等位基因频率明显高于对照组（P＜0.05），rs17300539位点AA基因型患者PCOS的风险显著高于GG基因型（P＜0.05），由此 rs17300539与 PCOS的发生具有相关性。

表1 rs17300539位点基因型和等位基因频率比较

表2 rs1501299位点基因型和等位基因频率比较

表3 rs2241766位点基因型和等位基因频率比较

表4 rs12495941位点基因型和等位基因频率比较

3.2 rs1501299位点与PCOS相关性分析 rs1501 299位点在ADIPOQ基因上位于第二个内含子，据相关对韩国PCOS患者的研究显示其与PCOS有相关性[16]，但是据相关研究显示该位点与伊朗人的PCOS的发病并无相关性[17]。本研究结果显示，研究组患者rs1501299位点C等位基因频率明显高于对照组，A等位基因频率明显低于对照组（P＜0.05），rs1501299位点CC基因型患者PCOS的风险显著高于AA基因型（P＜0.05），说明 rs1501299位点与 PCOS的发生具有相关性。

3.3 rs2241766位点与PCOS相关性分析 rs2241 766位点位于ADIPOQ基因的第二个外显子区域，该位点与PCOS的相关性具有一定的争议，有研究[18]显示其与PCOS的发病关系密切，也有研究[5]显示其与PCOS的发生并无显著相关性，本研究结果可以看出研究组和对照组rs2241766位点的基因型和等位基因频率分布之间的差异均无统计学意义（P＞0.05），分析原因可能是该位点与PCOS的相关性受人种、地域和样本量等因素影响。

3.4 rs12495941位点与PCOS相关性分析 rs12495 941位点分布于ADIPOQ基因的第一个内含子区域，针对该位点的研究目前较少，且研究多针对该位点与糖尿病或者心血管疾病相关，有研究[15]显示该位点与PCOS的发病并不相关，本研究结果显示研究组和对照组rs12495941位点的基因型和等位基因频率分布之间的差异均没有统计学意义（P＞0.05），由此可以看出rs12495941位点与PCOS的发病并不相关，与相关研究结果[5]一致。然而本次研究受客观条件的限制导致样本量比较小，并没有区分患者的民族差异等因素，因此可能对研究结果造成一定的影响，有必要增加样本量和区分不同民族患者，以深度分析其内在相关性。

综上所述，rs17300539位点与rs1501299位点可能是多囊卵巢综合征的易感基因位点，但是还需要进一步研究数据支持。

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