不同分子量残留对陈醋储存过程中沉淀物的影响

姜薇薇

(山东商业职业技术学院 食品药品学院，济南 250103)

老陈醋是我国著名的食醋，生产历史悠久。它用大麦、碗豆等原料自然通风制曲，再以高粱为主要原料配以其他辅料，采用低温酒精发酵，通过熏醅、淋醋、日晒与捞冰，制得色泽黑紫、质地浓稠、 酸味醇厚、具有特殊香味的老陈醋[1]。但是陈醋在储存过程中容易发生沉淀、返浑等问题一直是食醋行业多年来亟待解决的问题。据研究报道，食醋产生沉淀、返浑问题主要是由以下原因引起的：一是陈醋在酿造过程中存在未完全分解的淀粉、蛋白质等大分子物质在后期储存中发生聚沉，致使产品发生非生物性的浑浊沉淀现象[2]。二是生产过程中因操作不规范导致产品被微生物污染，出现生物性的浑浊和变质，严重影响食醋的感官质量及其商品价值[3]。本文从陈醋储存过程中非生物性的沉淀、返浑角度出发，探究陈醋产品中残留的不同分子量物质对陈醋储存过程中沉淀物的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

陈醋原醋：山东某陈醋酿造公司提供；盐酸、NaOH等化学试剂均为分析纯。

1.1.2 实验仪器

Pellicon-2膜过滤设备 美国默克密理博公司；L-8900氨基酸全自动分析仪 日本日立公司；ET76020浊度仪 美国Lovibond公司；pHS-2F pH 计 上海雷磁仪器厂；电子分析天平 上海京孚仪器有限公司；K9860全自动凯氏定氮仪 海能(济南)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本成分分析

蛋白质的测定：依照GB 5009.5-2010进行；灰分的测定：依照GB 5009.4-2010进行；脂肪的测定：依照GB 5009.6-2016进行；总酸的测定：依照GB/T 5009.41-1996进行；总糖的测定：依照文献[4]的总糖测定方法进行。

1.2.2 陈醋沉淀物收集方法

称取一定量的陈醋样品，以转速2000 r/min离心1 min，收集沉淀物，105 ℃干燥，即为陈醋沉淀物[5]。

1.2.3 不同分子量残留陈醋液的制备

本实验共选择6种有机滤膜，截留分子量分别为250，200，150，100，70，50 kDa分别对陈醋原液进行膜过滤实验，依照残留分子量大小分别得到原醋液、陈醋液1(残留分子量<250 kDa)、陈醋液2(残留分子量<200 kDa)、陈醋液3(残留分子量<150 kDa)、陈醋液4(残留分子量<100 kDa)、陈醋液5(残留分子量<70 kDa)、陈醋液6(残留分子量<50 kDa)，其中具体过滤条件参照文献[6]进行。

1.2.4 氨基酸组成及含量分析

称取一定量的样品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl溶液，抽真空至7 Pa后封口。将水解管置于110 ℃恒温烘箱内水解24 h后冷却，混匀，开管，过滤，吸取适量滤液，60 ℃抽真空蒸干，加入3～5 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液，摇匀，离心，取上清液，以外标法于安捷伦AG1100型氨基酸专用液相色谱仪定量测定[7]。

1.2.5 浊度的测定方法

使用Lovibond公司的ET76020型浊度仪进行测定，测定条件参照文献[6]进行。

1.2.6 陈醋的储存性实验方法

将本实验制备的不同分子量残留的陈醋液，在室温储存条件下，进行为期300天的储存性实验，观察不同储存时间陈醋液品质的变化。

1.2.7 陈醋色度的测定方法

色度在420，520，620 nm波长下进行比色测定[8]。

1.2.8 陈醋感官品质的测定方法

陈醋的感官评定方法：在文献[9]方法的基础上略作改动，选取20名专业的感官评定员组成感官评定小组，根据色泽、香气、滋味、形态4个方面进行感官评价，其中感官评分标准见表1，最终得到陈醋的感官评分为20位专业感官评分员的平均分。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria

2 结果与讨论

2.1 陈醋沉淀物基本成分分析

表2 陈醋沉淀物的基本成分分析(以干基计)Table 2 Analysis of the basic components of mature vinegar precipitate (on dry basis) %

由表2可知，陈醋中浑浊沉淀的主要成分为蛋白质，含量高达76.41%，其次是糖类，含量为14.87%，脂肪和灰分的含量相对较低，仅为4.30%和4.42%。这是由于陈醋在发酵过程中，原料中部分蛋白质和淀粉分解不完全，产生了一些分子量较大的多肽和多糖，这些大分子量的物质在后续的加工工艺和运输、储存、销售等环节中，随着时间的增加可在部分离子的作用下与多酚类物质结合，产生沉淀，使陈醋出现浑浊现象[10]，因此沉淀中的主要成分为蛋白质和糖类。

2.2 不同分子量残留陈醋中各组分分析

本文共选择6种有机滤膜，截留分子量分别为250，200，150，100，70，50 kDa分别对陈醋原液进行膜过滤实验，依次得到原醋液、陈醋液1(残留分子量<250 kDa)、陈醋液2(残留分子量<200 kDa)、陈醋液3(残留分子量<150 kDa)、陈醋液4(残留分子量<100 kDa)、陈醋液5(残留分子量<70 kDa)、陈醋液6(残留分子量<50 kDa)7种含有不同分子量残留的陈醋液。经分析，7种陈醋液中各组分见表3。

表3 不同分子量残留陈醋中基本组分分析Table 3 Analysis of the basic components of mature vinegar residues with different molecular weight g/dL

由表3可知，膜过滤对陈醋总酸和灰分的影响不大，随着滤膜的孔径逐渐减小，陈醋液中无盐固形物、蛋白质、糖类及脂类的含量逐渐减少，其中无盐固形物及蛋白质的减少量最大。对比陈醋原液和陈醋液1的基本组成成分可知，经250 kDa的滤膜过滤后陈醋液中的各组分改变最大，含量减少最为明显。这是因为陈醋液在发酵过程中产生的蛋白类多肽、多糖、已失活的菌体等大分子被除去，从而显著改变了各组分的含量[11]。

2.3 不同分子量残留陈醋储存过程中浊度的变化

2.3.1 大分子量物质(>250 kDa)对浊度的影响

将陈醋原液和陈醋液1在常温正常储存条件下进行储存性试验，储存过程中浊度的变化见图1。

图1 大分子量物质(>250 kDa)对陈醋储存过程中浊度的影响Fig.1 The effects of macromolecular substances(>250 kDa)on turbidity of mature vinegar during storage

由图1可知，陈醋液1(残留分子量<250 kDa)在长期储存过程中的浊度明显低于陈醋原液的浊度。在经过整个300天的储存周期后，陈醋原醋的浊度由初始的2.5 NTU升高为8.8 NTU，浊度升高了6.3 NTU。陈醋液1(残留分子量<250 kDa)的浊度由初始的0.63 NTU升高为2.8 NTU，浊度升高了2.17 NTU，浊度变化相对较小，由此可知，陈醋原液中含有的大分子量物质(残留分子量>250 kDa)是引起陈醋浊度变化的主要物质。

由图1可知，陈醋原醋储存前60天，浊度的变化较小，曲线升高较缓慢，储存时间在60～210天时，陈醋原液的浊度变化最大，图中曲线较陡，从3.2 NTU升高至8.3 NTU，储存时间在210～300天时，浊度变化不大。陈醋液1(残留分子量<250 kDa)储存前120天浊度基本没有发生变化，仅由最初的0.63 NTU升高至0.90 NTU，储存时间在120～240天时，浊度变化相对较大，从0.90 NTU升高至2.76 NTU，之后随着储存时间延长，浊度基本维持不变。对比两条曲线可知，陈醋液在储存过程中，前120天出现浊度升高现象主要是由其内部残留的大分子量物质(残留分子量>250 kDa)絮凝沉淀产生的，而分子量小于250 kDa的物质，在储存时间120天开始产生沉淀絮凝，使醋的浊度增加。

2.3.2 中分子量物质(100～250 kDa)对浊度的影响

4种陈醋液(陈醋液1、陈醋液2、陈醋液3、陈醋液4)在常温正常储存过程中浊度的变化见图2。

图2 中分子量物质(<250 kDa)对陈醋储存过程中浊度的影响Fig.2 The effects of medium molecular substances(<250 kDa) on turbidity of mature vinegar during storage

由图2可知，储存0天时，4种陈醋液的浊度相差不大，而经过300天的储存性试验，4种陈醋液的浊度均发生了明显的升高，其中陈醋液1(残留分子量<250 kDa)浊度升高了2.17 NTU，陈醋液2(残留分子量<200 kDa)浊度升高了1.92 NTU，陈醋液3(残留分子量<150 kDa)浊度升高了1.65 NTU，陈醋液4(残留分子量<100 kDa)浊度升高了1.32 NTU，由此可知，残留分子量越大，对浊度的影响越大，储存后陈醋的浑浊度越高。另外，由图2可知，4种陈醋液在前120天的储存过程中，浊度的变化均不大，这也意味着在该储存时间段中陈醋液中絮凝产生沉淀物质的量相对较少。陈醋液1、陈醋液2在第120天时浊度开始逐渐升高，而陈醋液3、陈醋液4则是在储存时间150天后才逐渐开始不断升高。这种不同表明了这4种陈醋中的部分物质，因分子量的不同，在各自不同的储存时间下开始产生絮凝，使得陈醋浊度升高。经分析可知，陈醋储存过程中120～150天产生的浊度升高，主要是由150～250 kDa分子量范围内物质絮凝沉淀产生的。而陈醋中分子量<150 kDa的物质，主要在储存150天后才会不断絮凝产生沉淀，引起陈醋浊度的变化。

2.3.3 小分子量物质(<100 kDa)对浊度的影响

3种陈醋液(陈醋液4、陈醋液5、陈醋液6)在常温正常储存过程中浊度的变化见图3。

图3 小分子量物质(<100 kDa)对陈醋储存过程中浊度的影响Fig.3 The effects of small molecular substances(<100 kDa) on turbidity of mature vinegar during storage

由图3可知，3种陈醋液在储存0天时，浊度均处于较低的水平，在储存的前150天，3种陈醋液的浊度升高较少。这表明陈醋中分子量<100 kDa的物质，在储存前150天内能较好地保持稳定，很少絮凝产生沉淀或已产生絮凝但未达到沉淀及改变浊度的状态。随着储存时间的不断延长，3种陈醋液在不同储存时间，分别出现浊度升高的现象，其中陈醋液4，在储存150天后，其浊度快速升高，陈醋液5在储存时间150～180天之间开始出现浊度快速升高的现象，而陈醋液6则在储存180天浊度开始快速增加。这表明陈醋储存过程中150～180天范围内产生的浊度升高，主要是由50～100 kDa分子量范围内物质絮凝沉淀产生的。而陈醋中分子量<50 kDa的物质，主要在储存180天后才会不断絮凝产生沉淀，引起陈醋浊度的变化。

综上所述，陈醋液在正常储存过程中，前120天出现浊度升高现象主要是由其内部残留的大分子量物质(分子量>250 kDa)絮凝沉淀产生的，储存时间120～150天范围内产生的浊度升高，主要是由150～250 kDa分子量范围内物质絮凝沉淀产生的。储存时间范围在150～180天内产生的浊度升高，主要是由50～100 kDa分子量范围内物质絮凝沉淀产生的。而陈醋中分子量<50 kDa的物质，主要在储存180天后才会不断絮凝产生沉淀，引起陈醋浊度的变化。

2.4 不同分子量残留对陈醋最终沉淀物的影响

不同分子量残留的陈醋液经过300天常温储存试验后产生沉淀的量不同，不同分子量残留对陈醋最终沉淀物的影响见图4。

图4 不同分子量残留对陈醋沉淀物的影响Fig.4 The effects of residues with different molecular weight on mature vinegar precipitates

由图4可知，随着残留分子量的不断减小，陈醋液中最终沉淀物的量不断降低，其中陈醋原液最终沉淀物的量最多，为0.113 g/dL。且陈醋原液经滤膜后，最终沉淀物的量显著减少，陈醋液1(残留分子量<250 kDa)、陈醋液2(残留分子量<200 kDa)、陈醋液3(残留分子量<150 kDa)，3种陈醋液储存后最终沉淀物的量差别不大，分别为0.051，0.046，0.043 g/dL，明显高于陈醋液4(残留分子量<100 kDa)中0.033 g/dL、陈醋液5(残留分子量<70 kDa)中0.030 g/dL、陈醋液6(残留分子量<50 kDa)中0.029 g/dL 3种陈醋液中最终沉淀物的量。

2.5 不同分子量残留对陈醋色度的影响

不同分子量残留对陈醋液色度的影响见图5。

图5 不同分子量残留对陈醋色度的影响Fig.5 The effects of residues with different molecular weight on chroma of mature vinegar

由图5可知，不同分子量残留对色度的影响不大。这是因为陈醋的色泽主要是酿造流程中熏醅工艺中产生的类黑精类物质赋予的，而这类赋予陈醋良好色泽的类黑精的分子量较小，仅有小部分处于10～80 kDa，绝大部分处于10 kDa以下[12]，因此，本文选择的6种膜过滤，孔径较大，基本不会将其除去，所以对色度的影响不大。

2.6 不同分子量残留对陈醋感官品质的影响

不同分子量残留对陈醋感官评分的影响见图6。

图6 不同分子量残留对陈醋感官评分的影响Fig.6 The effects of residues with different molecular weight on sensory score of mature vinegar

由图6可知，当储存天数为0天时，随着残留分子量的不断降低，陈醋液的感官评分呈现先基本不变后逐渐降低的趋势，但总体变化相对较小。这是因为储存时间0天时，250，200，150，100，70，50 kDa的膜过滤仅仅除去部分多肽和糖类等相对大一些的物质，对类黑精、总酸、乙醛、乙酸乙酯、乙醇、乙酸丙酯等小分子物质的影响不大，因此对色泽、滋味及风味方面基本没有影响[13]。但70，50 kDa的膜过滤，膜的孔径相对较小，会使得陈醋液中部分多肽和多糖损失，从而使得陈醋液的体态变稀，从而降低陈醋液5、陈醋液6的感官评分。

当7种陈醋液经过300天后，感官评分均有不同程度的降低，由图6可知，不同分子量残留对陈醋感官评分的影响呈现先升高后降低的趋势，但总体影响不大。这是因为经过300天的储存，陈醋原液产生较多的沉淀，从而使得陈醋原液的浊度升高，对陈醋体态的影响较大，从而降低了陈醋原液的感官评分。而随着残留分子量的不断减小，这一影响逐渐减弱，使得各陈醋液的感官评分呈现升高的趋势，当残留分子量<100 kDa时，陈醋液的感官评分达到最大值为82.3。而陈醋液5、陈醋液6的感官评分较低则是因为前期70，50 kDa的膜使得陈醋液中部分多肽和多糖损失、陈醋体态变稀，降低了其感官评分。虽然后期储存过程中，其产生的沉淀较少，感官评分的降低较少，但其最终的感官评分值仍较低。

2.7 不同分子量残留陈醋中氨基酸组成及含量分析

不同分子量残留陈醋液中氨基酸组成分析见表4。

由表4可知，7种陈醋液中氨基酸的含量有较大的不同，且随着陈醋液中残留分子量的不断降低，陈醋液中总的氨基酸含量呈现不断下降的趋势。其中陈醋原液中氨基酸的总含量最高，为8.30 mg/mL，陈醋液1、陈醋液2、陈醋液3、陈醋液4、陈醋液5中氨基酸的含量依次为7.15，6.79，6.64，6.36，5.88 mg/mL，陈醋液6中的氨基酸总量最低，为5.73 mg/mL。依照Lozano等[14]的方法计算各陈醋液中残留蛋白的平均疏水性，计算结果见表5。

表5 氨基酸的平均疏水性与最终沉淀物的相关性分析Table 5 The correlation analysis between average hydrophobicity and precipitates

注：“**”表示在0.01水平(双侧)上显著相关。

由表5可知，随着滤膜分子量的不断降低，各陈醋液中残留蛋白质和多肽的平均疏水性不断降低。而蛋白质或多肽分子的疏水性越强，越容易在储存过程中相互絮凝产生沉淀[15]。

为了研究残留蛋白质或多肽的平均疏水性和最终沉淀物的量的关系，本文分析了平均疏水性和最终沉淀物的量的相关性。由表5可知，各陈醋液中最终沉淀物的量与其残留蛋白质或多肽的平均疏水性呈显著正相关关系，相关系数为0.895。

3 结论

本文从陈醋储存过程中非生物性的沉淀角度出发，以6种滤膜进行超滤制备不同分子量残留的陈醋液，来探究陈醋中残留不同分子量物质对储存过程中沉淀物的影响。研究表明：沉淀物的主要成分为蛋白质，含量高达76.41%。不同分子量物质在储存过程中发生絮凝沉淀的时间不同，前120天是由分子量>250 kDa的物质絮凝产生的沉淀。120～150天范围内是由150～250 kDa分子量范围的物质絮凝产生的沉淀。150～180天内，则是由50～100 kDa分子量范围的物质絮凝产生的沉淀。而陈醋中分子量<50 kDa的物质，主要在储存180天后才会不断絮凝沉淀，引起陈醋浊度的变化。并且随着陈醋液中残留分子量越大越多，陈醋液最终沉淀物的量液越大，经分析，陈醋液中残留不同分子量物质对陈醋的色度和感官评分影响不大，但残留物中蛋白质或多肽的平均疏水性与最终沉淀物的量呈显著正相关关系，相关系数为0.895。

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