特应性皮炎不同中医证型外周血T细胞亚群及其相关细胞因子表达的研究

赵一丁，杨 洁，闫小宁，郎 娜

(1. 陕西省中医医院，西安 710003； 2. 陕西省中医药研究院，西安 710003； 3. 中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一种慢性、复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病，初发于婴儿期，呈慢性经过，常伴有哮喘或过敏性鼻炎，部分患者病情可以迁延至成年，严重影响患者及其家庭成员的生活质量。目前AD的病因及发病机制尚未完全明确，一般认为是在一定遗传背景和(或)环境因素作用下，造成机体皮肤屏障功能障碍或直接引起机体的免疫反应失调，导致变应性或非变应性炎症反应。T细胞亚群及其相关细胞因子在AD炎性反应的发生发展过程中起重要作用。本研究拟通过探讨AD患者外周血T细胞亚群相关细胞因子水平与中医证型之间的关系，以期为AD的中医辨证提供微观科学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 诊断标准 西医诊断符合Hanifin与Rajka诊断标准[1]，中医证型诊断符合国家中医药管理局四弯风辨证分型标准[2]，将患者分为风湿蕴肤证和血虚风燥证2型。其中风湿蕴肤证主症：皮肤潮红；瘙痒剧烈；糜烂渗出；丘疹水疱；次症：神倦便溏；遇风湿加重；舌淡苔薄腻；脉弦滑；血虚风燥证主症：皮肤干燥；肥厚或苔藓样变；瘙痒抓痕血痂；病程久，反复发作；次症：食后腹胀，便秘或溏；皮肤色暗或色素沉着；舌质淡胖；苔白脉滑；当患者符合以上证候中主症3项或3项以上，同时具备次症任何2项或2项以上即可诊断为该证型。

1.1.2 纳入和排除标准 2岁≤年龄≤60岁，性别不限，符合西医诊断标准及中医辨证分型标准，无严重心、脑、肝、肾等系统性疾病，排除妊娠及哺乳期妇女，近2周内未接受系统性糖皮质激素、免疫抑制剂治疗。

1.1.3 病例来源 表1显示，选取2015年5月至2017年4月陕西省中医医院皮肤科的54例就诊病理患者，其中男性30例，女性24例，年龄4～35岁，平均年龄(19.40±8.41)岁；病程4～17年，平均病程(10.01±3.69)年；辨证属风湿蕴肤证者20例，血虚风燥证者34例；招募健康志愿者20例对照组，其中男性11例，女性9例，年龄13～32岁，平均年龄(20.40±4.54)岁，2组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 一般资料特征

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 CD4/CD8/CD3检测试剂盒、Treg检测试剂盒，美国Beckman-Coulter公司；人白介素-4(IL-4)酶联免疫分析试剂盒、人白介素-12 (IL-12/P70)酶联免疫分析试剂盒、人白介素-10(IL-10)酶联免疫分析试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；流式细胞仪，美国Beckman-Coulter公司，EPICS XL；自动板式酶标仪，北京航宇浪琴医疗设备有限公司ZS-3；台式离心机，济南来宝医疗器械有限公司，TD-5 M；电热恒温培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司SKP-02.600)；超低温冰箱，日本SANYO公司MDF-192等。

1.2.2 检测方法 分别抽取纳入患者及健康志愿者空腹外周静脉血9 ml(肝素抗凝)，分别注入3个试管中，每管3 ml。

第1管用于细胞因子IL-4、IL-12及IL-10的检测，采用ELISA法检测。待检标本离心(1200 r/min，5 min)吸取上层血清注入EP管中；加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL，将样品加于酶标板孔底部，37 ℃反应120 min，弃去液体甩干，不用洗涤，每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃温育60 min，弃去孔内液体甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/孔甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37 ℃温育60 min，弃去孔内液体甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL /孔甩干，依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色，依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应，用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度。

第2管以肝素抗凝，用于CD3+、CD4+、CD8+的检测，采用流式细胞仪。取1支流式管作为样品测试管，将100 μL抗凝全血(EDTA)加入试管中，在管中加入10μLCD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD抗体，涡旋混匀后室温避光孵育15 min取出试管，每管加入500 μL红细胞裂解液OptiLyse C，涡旋混匀室温避光10 min，1200 r/min离心5 min，弃去上清液每管加入2 mlPBS，涡旋混匀1200 r/min离心5 min弃去上清液，每管加入500 μLPBS混匀，4 ℃避光1 h内上机检验。

第3管用于CD4+CD25highCD127lowTreg的检测，采用流式细胞仪。取2支流式管，编号1(同型对照管)和2(样品测试管)分别加入50 μL EDTA，在管1中加入10μLCD4-FITC、10μLIgG1-PC5、10μLIgG1-PE抗体，涡旋混匀后，室温避光孵育20 min，在管2中加入10μLCD4-FITC、10μLCD25-PC5、5μLCD127-PE抗体，涡旋混匀后，室温避光孵育15 min取出试管，每管加入500 μL红细胞裂解液OptiLyse C，涡旋混匀室温避光10 min，1200rpm离心5 min，弃去上清液，每管加入2mlPBS涡旋混匀，1200rpm离心5 min，弃去上清液，每管加入500μLPBS混匀，4 ℃避光1 h内上机检验。

在淋巴细胞中以CD3设门，CD4设门，可在以CD3为横坐标、CD4为纵坐标的二维散点图上把淋巴细胞分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD4-T细胞；以CD3设门，CD8设门，可在以CD3为横坐标、CD8为纵坐标的二维散点图上把淋巴细胞分为CD3+CD8+T细胞和CD3+CD8-T细胞，以CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞各占CD3+T细胞的比例作为CD4+T细胞和CD8+T细胞的表达水平；以CD4设门，可在以CD4为横坐标、侧向散射角(SSC)为纵坐标的二维散点图上把淋巴细胞分为CD4+T淋巴细胞和CD4-T淋巴细胞。在CD4+T的淋巴细胞中，以CD25、CD127设门，将CD4+CD25+细胞群平均荧光强度10倍的亚型细胞群定义为CD4+CD25highT细胞，获取设门内细胞团并保存数据，分析CD4+CD25highCD127low淋巴细胞比例，将CD4+CD25highCD127low淋巴细胞作为Treg的水平。

2 结果

2.1 特应性皮炎不同证型外周血T淋巴细胞亚群表达比较

表2图1～8显示，风湿蕴肤证及血虚风燥证AD患者外周血CD4+T细胞水平均高于对照组(P<0.05)，但两证型比较差异无统计学意义(P>0.05)；血虚风燥证AD患者外周血CD8+T细胞水平高于风湿蕴肤证AD患者及对照组(P<0.05)，风湿蕴肤证AD患者外周血CD8+T细胞水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；风湿蕴肤证及血虚风燥证AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平均明显低于对照组(P<0.01)，且风湿蕴肤证AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平低于血虚风燥证(P<0.05)；各组AD患者外周血CD3+T细胞水平及CD4+/CD8+比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组外周血T淋巴细胞亚群占总淋巴细胞比值比较

注：与对照组比较：※P<0.05,※※P<0.01；与风湿蕴肤证组比较：#P<0.05，##P<0.01

图1 风湿蕴肤证组CD3+流式直方图

图2 血虚风燥证组CD3+流式直方图

图3 风湿蕴肤证组CD4+流式散点图注：C2为CD4+T淋巴细胞

图4 血虚风燥证组CD4+流式散点图注：C2为CD4+T淋巴细胞

图5 风湿蕴肤证组CD8+流式散点图注：D2为CD8+T淋巴细胞

图6 血虚风燥证组CD8+流式散点图注：D2为CD8+T淋巴细胞

图7 风湿蕴肤证组Treg流式散点图 注：D门内为CD4+CD25highCD127lowTreg

图8 血虚风燥证组Treg流式散点图 注：D门内为CD4+CD25highCD127lowTreg

2.2 特应性皮炎不同证型外周血IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平比较

表2显示，风湿蕴肤证及血虚风燥证AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于对照组(P<0.05)，且风湿蕴肤证AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于血虚风燥证(P<0.05)；风湿蕴肤证及血虚风燥证AD患者外周血IL-12水平明显低于对照组(P<0.01)，并且风湿蕴肤证AD患者外周血IL-12水平明显低于血虚风燥证(P<0.01)，血虚风燥证AD患者外周血IL-12水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，血虚风燥证AD患者外周血IL-10水平高于风湿蕴肤证患者及对照组(P<0.05)，风湿蕴肤证AD患者外周血IL-10水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组血清IL-4、IL-12、IL-10水平比较

注：与对照组比较：※P<0.05，※※P<0.01；与风湿蕴肤证组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

中医学并无特应性皮炎的病名记载，根据其发病部位、临床特征及形态，常包括在“浸淫疮”“四弯风”“奶癣”“胎疮”“血风疮”等疾病中[3]。中医学认为，本病由先天禀赋不足、胎毒遗热、热郁肌肤而致；或由后天饮食不节、喂养失当导致脾失健运，复感风湿热毒，邪毒蕴结肌肤而致；反复发作、迁延日久或后天情志内伤，可致脾虚气血生化乏源，阴血、元气耗伤则血虚风燥、肌肤失养。1994年国家中医药管理局制定的《中华人民共和国医药行业标准·中医病证诊断疗效标准》将本病分为风湿蕴肤证和血虚风燥证两型[2]。本研究按照此辨证分型标准，通过对2种证型AD患者外周血T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的检测，探讨AD中医辨证的微观证据。

现代医学认为，T淋巴细胞亚群、Th1/Th2及Th17/Treg细胞网络失衡在AD的发病过程中有重要作用。有研究显示，AD患者外周血CD4+和CD4+/CD8+水平增高，CD8+水平下降，导致体液免疫功能亢进，细胞免疫功能低下[4]。本研究结果显示，AD患者外周血CD4+T细胞水平均高于对照组，血虚风燥证AD患者外周血CD8+T细胞水平高于风湿蕴肤型AD患者及对照组，说明AD患者体内T细胞的辅助与抑制功能存在失衡。AD急性期主要为Th2细胞活化引起免疫应答，产生IL-4、IL-5及IL-13等，表现为红斑、丘疹、水疱甚至黄水浸淫、糜烂、结痂，可伴有烦躁不安、大便干结或黏腻、小便短黄、舌红苔黄腻、脉滑数等，证属风湿(热)蕴肤，慢性期免疫反应则向Th1细胞占优势的免疫应答转变，IL-12及GM-CSF呈过表达[5]，表现为皮肤肥厚、苔藓化、干燥、瘙痒剧烈，伴有倦怠乏力、食少腹胀、舌质淡红少津、苔少、脉沉弦等，证属血虚风燥。有研究显示，(风)湿热蕴肤征象表现越明显，IL-4、IL-17表达越高，而病久耗伤阴血、血虚风燥，逐渐成为慢性期表现，此时相对较高的IFN-γ表达增加[6]，与本研究结果相符。

Treg细胞是新型CD4+T细胞亚群，主要通过细胞间接触抑制和分泌抑制性细胞因子如TGF-β、IL-10而发挥免疫调节作用[7]，它与Th17细胞平衡失调可引起AD皮损向急性期发展，Treg细胞可分为CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞、NKT Treg细胞和双阴性Treg细胞，其中CD4+Treg细胞与特应性皮炎的发病密切相关，CD25是CD4+Treg细胞的分子标志物，但效应性T细胞也表达CD25，只有高表达CD25的CD4+Treg细胞才具有免疫调节作用，而CD127在CD4+Treg细胞表面特异性低表达，检测时不用破坏细胞膜[8]，因此本研究采用CD4+CD25highCD127low作为筛选Treg细胞的标准。研究结果显示，AD患者外周血Treg细胞低于健康对照组，说明AD患者体内存在Treg细胞数减少导致免疫抑制效应的不足[9]，且风湿蕴肤证患者外周血Treg水平低于血虚风燥证患者，IL-17水平高于血虚风燥证患者，可能说明慢性期平衡转向Treg、Th1方向，IL-10呈高表达。在辨证论治过程可以从IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平的高低及CD4+、CD8+、Treg细胞的数量初步判断患者的病情阶段及中医辨证分型，从而为遣方用药提供依据。

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